ПРО МЕХАНІЗМ РЕАКЦІЇ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГІДУ З ХІТОЗАНЕМ - тема наукової статті з хімії з журналу -
Ціна:
Автори роботи:
Науковий журнал:
Рік виходу:
Текст наукової статті на тему «ПРО МЕХАНІЗМ РЕАКЦІЇ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГІДУ З ХІТОЗАНОМ»
БІООРГАНІЧНА ХІМІЯ, 2009, том 35, № 3, с. 397-407
ПРО МЕХАНІЗМ РЕАКЦІЇ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГІДА
*Московський державний текстильний університет ім. АН. Косигіна, Москва; **Установа української академії наук Інститут хімічної фізики РАН ім. Н.М. Семенова, Москва;
***Установа української академії наук Інститут молекулярної біології ім. В.А. Енгельгардта РАН,
Розглянуто закономірності взаємодії амінополісахариду хітозану з глутаровим альдегідом (GA). З використанням методів ЯМР-спектроскопії детально вивчені рівноважні форми GA у воді, встановлено обмін протонів 0=СНСН2-груп на дейтерій при рН 5.6, що свідчить про наявність аніону продукту першої стадії альдольної реакції, а при рН > 7.2 показано утворення продуктів альдольної реакції та альдольної конденсації. Вивчено кінетика реакції взаємодії аміногруп хітозану з GA методом УФ-спектроскопії, кінетика гелеутворення в розчинах хітозану в присутності GA і кінетика зміни міцності гелів, отримані ІЧ-спектри зразків зшитого хітозану. Показано, що хітозан каталізує полімеризацію GA з утворенням неоднорідних продуктів, при цьому довжина олігомерних ланцюгів у модифікованому або зшитому хітозані та концентрація сполучених зв'язків зростає зі збільшенням концентрації GA та рН реакційного середовища.
Ключові слова: хітозан, глутаровий альдегід, реагент, що зшиває, підстави Шиффа, аль-дольна реакція, альдольна конденсація.
Реакція зшивання білків глутаровим альдегідом (ВА) протягом багатьох років застосовується для іммобілізаціїферментів, тобто одержання різних форм гетерогенних біокаталізаторів для фармакологічного, медико-технічного та біотехнологічного використання [1-3]. Зараз ця реакція знову набула актуальності у зв'язку з широким використанням амінополісахариду хітозану - унікального біополімеру, який має власну біологічну активність (антимикробну активність, імуностимулюючу дію, репаративну здатність) [4-6]. Наявність реакційноздатної аміногрупи в піранозній мономерній ланці хітозану робить його перспективним носієм біологічно активних сполук [7].
Модифікація біфункціональними реагентами, що зшивають, найбільш поширеним з яких є вА, дозволяє отримати на основі хітозану плівки, мікрокапсули, гранули, волокна, нерозчинні у воді, але володіють високою вологоутримуючою здатністю гідрогелі і
композиційні матеріали та зафіксувати в їх структурі лікарські сполуки, ферменти та інші білки.
У літературі існують численні і часом суперечливі дані про стійкість і структуру в водних розчинах, які підсумововані в огляді [3]. На підставі вивчення ЯМР-спектрів 25 і 50%-них розчинів вА було показано, що існує в рівноважній суміші вільного альдегіду (I), моно- (II) і дигідрату (III), а також циклічних цис- (IV) і транс - (V) ізомерів (схема 1) [8]. Зазначалося також, що кількісне співвідношення різних форм трохи залежить від концентрації вА і визначається, головним чином, температурою: підвищення її призводить до значного збільшення вмісту альдегіду (I) [8]. За допомогою УФ-спектроскопії було показано, що в концентрованих розчинах вА (70%) є також полімерна форма (VI) вА [9]. Вплив рН на співвідношення рівноважних форм у воднихрозчинах в літературі практично не розглядалося, і це незважаючи на те, що комерційні розчини вивчалися досить докладно [8-10].
Схема 1. Структура форм ОД у водяних розчинах.
У лужному середовищі (рН 8-13) ОД полімеризується, причому швидкість полімеризації збільшується при підвищенні концентрації гідроксильних іонів [11]. Механізм альдольної реакції та альдольної конденсації представлений на схемі 2. На першій стадії утворюється альдоль (VII) (аль-
реакція), який далі дегідратується до ненасиченого похідного (VIII) (аль-дольная конденсація). Подальша конденсація продуктів (VII) та (VIII) призводить до полімерних продуктів (IX) з молекулярними масами 1200020000 [11].
Схема 2. Механізм альдольної реакції та альдольної конденсації у лужному середовищі.
Незважаючи на те, що GA широко використовується в різних областях, не сформувалася єдиної думки про механізм реакції ОД з білками, хітозаном та іншими полімерами, що містять аміногрупи, що, зокрема, пов'язано з непостійністю співвідношення між рівноважними формами GA. Вивчення закономірностей взаємодії хітоза-на з GA, формування уявлень про механізм реакції та структуру продуктів дозволить визначити перспективи використання цієї системи для отримання нових матеріалів для біотехнології та медицини, а також вибрати оптимальні умови для їх отримання.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
Традиційні уявлення пояснюють рН-за-висимість реакції зшивання білків глутаровим альдегідом зниженням реакційної здатності протонованих аміногруп в реакції з карбонільними групами. При цьому було показано, що в кислих середовищах реакція практично не йде, а зшивання спостерігається при рН & gt; pI, коли NH2-групи білка депротоновані. Для хітозану ступіньпротонування аміногруп [12] визначає ще й розчинність цього полісахариду у воді. pH Розчинів хітозану в оцтовій кислоті залежно від його молекулярної маси, ступеня дезацетилювання та концентрації розчину коливається від 3.5 до 4.5, проте реакція зшивки протікає з високою швидкістю [13]. рН 2%-ного розчину хітозану з М 180 кДа в 2% оцтовій кислоті становить 4.1. Ступінь протонування аміногруп (а) у своїй рН дорівнює 0.9, тобто. тільки 10% аміногруп реакційно-здатні в реакціях нуклеофільного приєднання. Збільшити кількість депротонованих аміногруп у розчині хітозану можна додаванням №він у кількості, що не призводить до осадження полімеру. Додавання 0.5 М розчину №он у розчин хітозану до рН 5.6 (що на 0.1 нижче рН точки помутніння) дозволяє, зберігши гомогенність розчину, збільшити до 50% кількість депротонованих аміногруп.
Для вивчення впливу рН та температури на рівновагу між різними формами ОД у його водних розчинах (схеми 1 і 2), а, отже, і на реакційну здатність GA у його реакції з аміногрупами хітозану, методом яМР-спектроскопії були детально вивчені розчини GA при різних значення рН: 3.1, відповідному рН комерційного 25%-ного водного розчину, 4.1, відповідному рН 2%-ного розчину хітозану в 2%-ній оцтовій кислоті, 5.6 - максимальному значенні рН, при якому розчин хітозану зберігає гомогенність, а також 7.2, 8.6 та 9.0 при різних температурах (305, 315 та 325 К).
ЯМР-спектри комерційних 25 і 50% розчинів GA при рН 3.1 і 4.1 практично збігаються і не змінюються в часі (до 3 діб). При рН 5.6
спостерігався обмін протонів ОСНСН2-груп на дейтерій, при більш лужних значеннях рН поряд з обміном фіксувалися додаткові сигнали у спектрах ЯМР, а при рН 8.6 та 9.0за кілька годин утворювався осад полімерних форм GA.
На рис. 1 і 2 наведені XH-і 13С-ЯМР-спектри при 305 K свіжоприготовлених розчинів 25% GA, розведених в 5 разів D2O. Сигнали протонів альдегідних груп (форми (І) та (ІІ)) спостерігаються при 9.6 м. д. (рис. 1) і практично збігаються. У разі форми (I) протон альдегідної групи проявляється у вигляді триплетного сигналу з КССВ, що дорівнює 1.2 Гц, а цей же протон у формі (II) дає розширений син-глет. Малі значення КССВ характерні для альдегідних похідних [14]. У 13С-ЯМР-спектрах (форми (I) та (II)) спостерігаються два сигнали в області 208-209 м. д.
Сигнали протонів гідратованих альдегідних груп (форми (II) і (III)) дають два триплетних сигнали, що перекриваються при 5.00 м. д. У 13С-ЯМР-спектрах цих форм спостерігаються два сигнали біля
91 м. д. Сигнали аксіально розташованих протонів у циклічній формі (IV) виявляються у вигляді дублету дублетів при 4.8 м. д. з КССВ 9.6 та 2.1 Гц (рис. 1). У 13С-ЯМР-спектрах форми (V) спостерігаються відповідні сигнали при 95 м. д. Для циклічної трансформації (V) характерна наявність у протонному спектрі дублету дублетів при 5.28 м. д. з КССВ 6.0 і 2.0 Гц і сигналу близько
92 м. д. у 13С-ЯМР-спектрі.
У 13С-ЯМР-спектрах (рис. 2) спостерігаються 19 сигналів атомів вуглецю. Форма (II) може тео-
5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 м.д.
С— с^ с— с^ с^ с^ с— с— с— с—
Для подальшого читання статті необхідно придбати повний текст. Статті надсилаються у форматіPDFна вказану при оплаті пошту. Термін доставки становитьменше 10 хвилин. Вартість однієї статті -150 рублів.