Проста лінійна імунодифузія за Уденом - Біологія
2. Проста лінійна імунодифузія за Уденом
Гель, що містить антисироватку, поміщають у скляні трубки чи пробірки. Трубки вертикально занурюють розчин антигену, і в пробірках розчин антигену нашаровують на гель. Антигени дифундують в гель зі швидкістю, пропорційної їх концентрації, і, з'єднавшись зі специфічними антитілами, утворюють з ними білувато-каламутні преципітати. Число ліній преципітації залежить від кількості реагуючих систем антиген-антитіло. Чим триваліша дифузія, тим далі фронт преципітації кожної лінії віддаляється від кордону, що розділяє гель і рідину. Відстань, яку він проходить за певний час при строго постійної концентрації антисироватки в гелі, залежить тільки від концентрації антигену, що дифузує. За постійних умов досвіду (температура, серія антисироватки та її концентрація в гелі, концентрація самого гелю) за допомогою простої лінійної імунодифузії можна визначати кількість антигену.
2.2. Проведення імунодифузії Реагенти та прилади
Моноспецифічні антисироватки, стандартні розчини антигенів та робочий стандарт, веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 та іонною силою 0,1. Спеціальний агар Noble; скляні капіляри для визначення гематокриту довжиною близько 50 мм, із внутрішнім діаметром 1-1,5 мм; вимірювальна лупа з точністю до 0,1 мм.
У скляні капіляри насмоктують і видують назад 1% гарячий золь агару на воді. Потім капіляри висушують за 70°С. Агарова плівка, що утворилася, посилює зчеплення гелю зі склом і перешкоджає утворенню щілин, в які міг би проникнути антиген.
У 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендують 2 г сухого агару та нагрівають на водяній бані до розплавлення. Агар охолоджують до 48°Ззмішують з рівним об'ємом підігрітої до 48°С антисироватки. У цю суміш занурюють капіляри, щоб вона заповнила їх на 2-3 см. Коли гель затвердіє, капіляри готові до вживання.
Капіляри занурюють у розчини антигенів, але перед зануренням капілярів антиген слід довести температуру всіх реагентів до потрібної величини, наприклад до 4°С. Реакція триває 48 год. Потім вимірюють відстань, яку пройшов фронт преципітації у кожному капілярі.
Для того, щоб антиген міг дифундувати в гель, що містить антитіла, він повинен бути надлишком. Швидкість міграції преципітату можна обчислити, розділивши відстань h, на квадратний корінь з часу дифузії t.
При постійному часі дифузії між логарифмом концентрації антигену та відстанню, яка проходить фронт преципітації, існує пряма лінійна залежність. Нахил калібрувальної кривої прямо пропорційний квадрату коефіцієнта дифузії антигену і обернено пропорційний концентрації антитіл у гелі та в'язкості гелю.
Критичним фактором є температура. Тривалість інкубації залежить від величини молекул, що дифундують, найчастіше триває 12, 24 або 48 годин.
3. Проста радіальна імунодифузія по Манчіні
На рівну поверхню рівномірним шаром наносять гель, що містить антитіла. У гелі вирізують лунки та заповнюють їх розчином антигену. Молекули антигену радіально дифундують з лунки і, зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. Доки в лунці зберігається надлишок антигену, відбувається поступове збільшення діаметра кільця преципітації.
3.2. Проведення дослідження Реагенти та прилади
Моноспецифічні антисироватки; стандартні розчини антигенів; робочий стандарт; веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 та іонною силою0,1; агар; рамки для закріплення предметного скла, штативи для цих рамок, кювети для елюції з комплекту для електрофорезу; вимірювальний інструмент із точністю до 0,1 мм; мікрошприц.
Нагрівають 1,5 г агару до повного розплавлення в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяній бані і, охолодивши до 48°С, змішують у потрібній пропорції з антисироваткою, підігрітою до тієї ж температури. Суміш розливають по 2 мл на предметне скло, розташоване строго горизонтально. Золь повинен рівномірно розподілитися поверхнею скла. Щоб посилити зчеплення гелю зі склом, рекомендується заздалегідь покрити скло тонкою агаровою плівкою.
У платівці гелю вирізають лунки, розраховані на 2 мкл антигенного розчину кожна. Після внесення антигену пластинки гелю поміщають у вологу камеру та проводять імунодифузію при кімнатній температурі. Кільця преципітації можна вимірювати прямо на вологій платівці. Якщо преципітати видно недостатньо чітко, то спочатку елююють білки, що не преципітували, у двох змінах 0,15 М розчину NaCl по 12 год, потім гель висушують і забарвлюють барвниками, наприклад амідо-чорним, і висушують знову.
Площа, що займається преципітатом до кінця дифузії, прямо пропорційна початковій концентрації антигену в лунці. Для побудови калібрувальної кривої беруть або площу преципітату як функцію концентрації антигену, або логарифм діаметра преципітату як функцію логарифму концентрації антигену:
де S – площа преципітату, включаючи S0, S0 – площа стартової лунки та QAГ – кількість антигену.
Результати імунодифузії суттєво не залежать від температури. Досвід може бути поставлений за 4, 20 або 37°С. Слід уникати тільки різких (понад 5°) коливань температури.
Необхідна тривалість імунодифузії залежитьвід природи досліджуваного антигену. Перший орієнтовний вимір преципітатів можна зробити вже через 24 год.
3.3. Оцінка методу
У межах своєї чутливості радіальна імунодифузія придатна для кількісного визначення будь-якого антигену, якщо є відповідні моноспецифічні антисироватки та чисті або стандартні антигени, щоб побудувати калібрувальну криву для даної системи.
За допомогою цього методу частіше визначають білкові антигени, наприклад, білки сироватки крові, цереброспінальної рідини, секретів залоз. Радіальна імунодифузія придатна також для порівняльного якісного та кількісного аналізу імунохімічно близьких білків.
4. Нефелометрія 4.1. Принцип методу
Розчин антигену змішують з відповідною моноспецифічною антисироваткою та суміш інкубують. При цьому утворюються імунні агрегати, здатні розсіювати світло, що проходить. Інтенсивність розсіювання або поглинання світла, що проходить прямо пропорційна кількості комплексів антиген-антитіло, і її можна вимірювати фотометрично.
Якщо обсяги реагентів, розведення антисироватки, час і температура інкубації постійні і єдиною змінною величиною є концентрація антигену, останню можна визначити по кривій екстинкції. Щоб побудувати таку криву, антисироваткою інкубують розчини антигену зростаючої концентрації. Спочатку зі збільшенням концентрації антигену крива екстинкції йде нагору, потім, після деякого максимуму, знижується. При постійній кількості антитіл підйом концентрації антигену збільшує як кількість, а й величину імунних агрегатів. При оптимальному співвідношенні антигену та антитіл кількість та розмір імунних агрегатів досягає максимуму. Область оптимальних співвідношень називають зоноюеквівалентності. Подальший підйом концентрації антигену веде до зменшення агрегатів.
4.2. Проведення дослідження
Реагенти та прилади
Забуферений фосфатами розчин NaCl. 11,9 г Na2HPO4·2H2O розчиняють у 1000 мл 0,15 М розчину NaCl; 9,1 г KH2PO4 розчиняють у 1000 мл 0,15 М розчину NaCl. Виходить буфер із pH 7,5.
Стандартні розчини, досліджувані зразки та антисироватки розводять забуференим розчином NaCl pH 7,5. Визначення антигенів виробляють з кролячими антисироватками у розведенні 1:5-1:20. Для побудови кривої екстинкції спочатку готують серію розведень антигену від 05 до 10 мг на 100 мл. До останніх розведень стандартної сироватки або розчину чистого білка додають рівний об'єм розбавленої антисироватки, перемішують і залишають при кімнатній температурі (20°С) на 2 год. проби (буфер + антисироватка). З досліджуваним зразком роблять так само, як зі стандартними розчинами. Визначають його екстинкцію і по висхідній частині кривої встановлюють концентрацію антигену. Якщо доводиться досліджувати каламутні або забарвлені розчини антигенів, слід заздалегідь виміряти їхню власну екстинкцію, щоб врахувати її в оцінці результатів. Потім з урахуванням розведення вихідного матеріалу обчислюють концентрацію антигену, що досліджується.
Повну впевненість у тому, що отримана величина екстинкції відповідає області надлишку антитіл, що дає дослідження, проведене з декількома розведеннями антигену. Умови інкубації мають бути суворо незмінними. Для фотометрії слід вибирати довжину хвилі, що лежить поза областей поглинання гемоглобіну (400 – 420 нм). Необхідно також враховувати спектрвласного поглинання реагентів та його суміші до утворення імунних агрегатів.
4.3. Оцінка методу
Переваги нефелометрії – відносна простота та швидкість процедури, а також можливість її автоматизації. Однак цей метод висуває особливі вимоги до якості антисироватки. Вона повинна містити достатньо антитіл, щоб у розведенні антитіл не менше 1:5 забезпечити величину максимальної екстинкції вище 0,2. Антисироватка має бути прозорою.
5. Імунодот та імуноспот
Твердофазний імуноферментний аналіз є найбільш популярним методом у діагностиці різних вірусних, бактеріальних, грибкових та паразитарних хвороб людини та тварин. Однак цей метод має низку недоліків. У модифікованому варіанті для адсорбції різних антигенів використовують нітроцелюлозні фільтри. Таку модифікацію називають dot-ELISA (точковий твердофазний імуноферментний аналіз). У dot-ELISA мінімальні обсяги розчинів антигену або антитіл наносять на нітроцелюлозну підкладку у вигляді серії крапок. Преципітуючі хромогенні субстрати на білому нітроцелюлозному фільтрі утворюють кольорові плями. Фільтри з результатами аналізу можуть зберігатися у темряві багато років без втрати забарвлення.
У dot-ELISA можна застосовувати різні препарати антигенів. На нітроцелюлозних мембранах можна сорбувати як життєздатні або фіксовані формаліном найпростіші, так і супернатанти, отримані після руйнування клітин.
Пляму антигену наносять обсягом від 0,1 до 3 мкл. У разі препаратів солюбізованих антигенів краще використовувати мембрани з малим діаметром пор. При застосуванні цілих клітин величина пір не відіграє великої ролі.
Усі стадії інкубації та промивання виконують при кімнатній температурі. Спочатку диски з антигеномобробляють блокуючим розчином (3 - 5%-ний розчин очищеного бичачого сироваткового альбуміну в сольовому триетаноламіновому буферному розчині). Можна успішно застосовувати і цільну кінську сироватку або 1% розчин нормальної сироватки кролика у фосфатному буферному розчині з NaCl. При виявленні антитіл 50 мкл сироватки в 1% розчині БСА-СТБ інкубують на диску. Антитіла специфічно зв'язуються з антигеном, сорбованим на диску. Потім диски тричі промивають у розчині детергенту (0,05%-ний розчин нонідету Р-40 у СТБ, 0,05%-ний розчин твина-20 у сольовому розчині трис- НCl). Після промивання диски інкубують з 50 мкл кон'югату афінно очищених антивидових антитіл із ферментом (пероксидаза, лужна фосфатаза).
Після відмивання незв'язаного матеріалу додають преципітуючий хромогенний субстрат. При окисленні субстрату ферментом у присутності пероксиду водню утворюється чітка пляма.
При визначенні антигенів проби наносять безпосередньо на підкладку, потім проводять імунологічну реакцію або зі специфічними антитілами та кон'югатом вторинних антитіл з ферментом та хромогенним субстратом, або з кон'югатом специфічних антитіл з ферментом-маркером та субстратом.
У двосайтовому dot-ELISA для визначення антигенів спочатку на підкладку наносять специфічні антитіла. Антигени у пробі зв'язуються з антитілами. Потім додають мічені специфічні антитіла проти іншого епітопу антигену і проводять реакцію з субстратом, що преципітує. Для таких методик характерна висока специфічність.
Важливою перевагою методу dot-ELISA є можливість застосування для найрізноманітніших медичних цілей. Усі модифікації dot-ELISA відрізняються економічною витратою реагентів, не вимагають приладів з електроживленням для реєстраціїрезультатів.
1. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Нові методи імуноаналізу. - М.: Світ, 1991. - С.116.
2. Імунологічні методи. За ред. Х. Фрімеля. - М.: Світ, 1979. - С. 31 - 55.