Серологічний діагноз бруцельозу
Реакція Хеддльсона (пластинчастий метод)
Перевага цього методу полягає у простоті постановки реакції, швидкому отриманні результатів та чутливості реакції. Як антиген для постановки реакції Хеддлсона і Райта застосовують єдиний бруцельозний діагностикум. Реакцію ставлять на звичайному шибці, ретельно вимитому, знежиреному склі, розкресленому на квадрати величиною 4 x 4 см кожен, по горизонталі має бути 5 квадратів. На першому квадраті з лівого боку записується номер випробуваної сироватки, наступні квадрати зліва направо розливають (мікропіпеткою або 1 мл градуйованої піпеткою) випробувану сироватку в наступних дозах: 0,04, 0,02, 0,01 і 0,03 (контроль . До перших трьох доз сироватки додають по 0,03 мл антигену. До останньої дози сироватки (0,03) додають 0,03 мл фізіологічного розчину. Сироватку обережно змішують із антигеном паличкою, починаючи з мінімальної дози сироватки. Контроль антигену ставлять, додаючи 0,03мл фізіологічного розчину до 0,03мл антигену. Потім скло злегка підігрівають над полум'ям спиртування так, щоб відбувалося рівномірне нагрівання всієї поверхні скла.
У разі позитивної реакції в перші хвилини в краплях сироватки з антигеном з'являються пластівці (аглютинат). Максимальний термін спостереження – 8 хвилин. Контроль сироватки ставлять з кожною випробуваною сироваткою для виключення спонтанної аглютинації; контроль антигену ставлять один (за будь-якої кількості випробуваних сироваток) для виключення спонтанної аглютинації застосовуваного антигену. Облік реакції проводять неозброєним оком за такою схемою: а) повне просвітлення рідини з великими і дрібними пластівцями, тобто. 100% аглютинації (4+); б) майже повне просвітлення рідини з ясно помітними пластівцями, тобто. 75% аглютинації(3+); в) незначне просвітлення рідини із помітними пластівцями, тобто. 50% аглютинації (2+); г) каламутна рідина з ледь помітною зернистістю (+); д) рівномірна каламутна рідина (-).
Для оцінки результатів рекомендується наступна схема: а) аглютинація на 4+ у всіх дозах сироватки – результат "різко позитивний"; б) аглютинація не менше 2+ у всіх дозах сироватки – результат "позитивний"; в) аглютинація тільки в першій або першій і другій дозах сироватки - результат "сумнівний"; г) відсутність аглютинації у всіх дозах сироватки – реакція "негативна".
Для діагностики бруцельозу має значення лише позитивний результат реакції. При сумнівному або негативному результатах реакції та наявності епідемічних та епізоотичних показань, а також у стаціонарі та при обстеженні донорів, де необхідне визначення титру аглютинінів та їх динаміки, слід застосовувати реакції Райта та Кумбса, РПГА та ІФА.
Роз-Бенгал проба (РБП)
Роз-Бенгал проба, в порівнянні з іншими методами серологічної діагностики бруцельозу, володіє наступними перевагами: великою чутливістю, здатністю в короткі терміни після зараження виявляти специфічні бруцельозні антитіла і, завдяки кислій реакції антигену, інгібувати прояви неспецифічних антитіл, а також стабільністю показань постановки, що вимагає невеликої витрати праці та часу, чіткістю та швидкістю одержуваних результатів.
Сироватки крові, що підлягають дослідженню, мають бути прозорими, без домішки еритроцитів. Їх досліджують не пізніше ніж через 4 дні зберігання при температурі плюс 4-8 °С.
Допускається досліджувати сироватки, консервовані сухою борною кислотою (2% борної кислоти до об'єму сироватки).Консервовані сироватки є придатними для дослідження протягом 14 днів.
Антиген являє собою суспензію інактивованих нагріванням та фенолом бруцел у буферному розчині, пофарбованих бенгальським рожевим у рожевий колір. Розфасований у флакони із темного скла, підлягає зберіганню у темному сухому місці при температурі плюс 4-12 °С. Термін придатності антигену за умови дотримання умов зберігання 18 місяців з дня його виготовлення.
Антиген у флаконах без етикетки (напису) або з тріщинами, що містить сторонню домішку, пластівці, що не розвиваються, цвіль, зі строком придатності, що минув, або що зазнавали заморожування, для застосування не придатний.
Перед вживанням антиген витримують 30-40 хв. при кімнатній температурі і потім ретельно струшують.
Техніка постановки Роз-Бенгал проби: реакцію проводять на чистих сухих металевих емальованих пластинках або кахельних плитках з лунками за кімнатної температури (плюс 18-30 °С).
Досліджувані сироватки крові в дозі 0,03 мл вносять на дно лунки шприцом-напівавтоматом або мікропіпеткою, які промивають тричі фенолізованим (карболізованим) фізіологічним розчином і підсушують фільтрувальним папером.
У кожну лунку поруч із сироваткою піпеткою-крапельницею вносять рівну кількість (0,03 мл антигену) і ретельно змішують активним рухом ручного полізмішувача на 5 або 25 проб для отримання однорідної суміші, розподіляючи її при всій поверхні лунки.
Пластину із внесеними на неї сироватками та антигеном похитують протягом 4 хв обережними обертальними рухами вручну або за допомогою автоматичного приладу, призначеного для цієї мети. При позитивній реакції з'являються пластівці аглютинату рожевого кольору.
На початку роботи ставлять контроль антигену знормальної (негативної) і позитивної аглютинуючою сироватками в тих же дозах, а також контроль антигену на спонтанну аглютинацію (до 0,03 мл антигену додають 0,03 мл фізіологічного розчину).
Облік реакції проводять неозброєним оком протягом 4 хв. після змішування сироватки з антигеном при злегка похилому положенні платівки.
Аглютинацію, яка настає пізніше, ніж через 4 хв – не враховують.
Реакцію вважають позитивною за наявності вираженої аглютинації у вигляді дрібних або великих пластівців рожевого кольору.
За відсутності аглютинації (суміш гомогенна, рівномірно забарвлена) реакцію вважають негативною.
Після обліку реакції пластинки дезінфікують зануренням на 5 хв 3% розчин фенолу або 1% розчин хлораміну, потім ретельно промивають водопровідною водою, висушують і використовують повторно. Для цих цілей можна застосовувати касети та штативи сушарки.
При нечітко вираженій аглютинації проводять повторне дослідження.
За результатами повторного дослідження дають остаточну оцінку реакції (позитивна чи негативна).
Сироватки, з якими отримана позитивна РБП, досліджують у РА та РСК (РДСК) для встановлення титру аглютинінів та наявності комплементзв'язуючих антитіл. Сироватки, з якими отримана негативна РБП, додатково РА і РСК (РДСК) не досліджують.
Кільцева реакція з молоком
Кільцева реакція застосовується з метою орієнтовної перевірки благополучних по бруцельозу молочних стад та перевірки молока на ринках.
Сутність кільцевої реакції полягає в тому, що у молоці бруцельозних тварин при додаванні антигену утворюється комплекс антитіла з антигеном, який адсорбується жировими частинками молока. Жирові частинкивнаслідок своєї малої питомої ваги піднімаються вгору, захоплюючи адсорбований аглютинат, який залежно від кольору антигену утворює на поверхні рідини забарвлене кільце.
Для кільцевої реакції застосовують кольоровий антиген Триленко, що представляє завись убитих, пофарбованих бруцельозних мікробів.
Для дослідження необхідно брати цільне, краще свіже молоко або консервоване формаліном (з розрахунку 0,1 мл 10% розчину формаліну на 10 мл молока).
У пробірку беруть 2 мл молока і додають 0,1 мл (2 краплі) концентрованого антигену, ретельно струшують та поміщають у водяну баню або термостат на 45-50 хв при температурі 37-39 °С.
Облік реакції: а) якщо у верхній частині стовпчика молока (у шарі вершків) чітко виражено синє кільце, а решта молока біла, реакція оцінюється позитивною – 100 або 75 % аглютинації (++++ та +++); б) за наявності досить вираженого синього кільця у шарі вершків, а решта молока синюватого кольору, реакція оцінюється позитивною – 50 % аглютинації (++); в) якщо синє кільце у шарі вершків слабо виражене і весь стовпчик молока має синій колір, реакція вважається сумнівною – 25 % аглютинації (+ та ±); г) якщо стовпчик молока рівномірно забарвлений у синій колір, а шар вершків залишається білим або злегка жовтуватим, реакція негативна (-).
Молоко від корів із сумнівною реакцією досліджують повторно через 10-15 діб. При отриманні негативного чи знову сумнівного результату тварин вважають благополучними за бруцельозом.
Пластинчаста реакція аглютинації (дослідження молока)
Ця реакція застосовується для дослідження тільки свіжого молока та молочної сироватки. Не підлягає дослідженню пастеризоване, кип'ячене та заморожене молоко(у такому молоці антибруцельозні аглютинини руйнуються), а також молоко, що має кислотність вище 30 °С по Тернеру (щоб уникнути неспецифічних результатів).
Реакцією аглютинації можна досліджувати молоко жирне (цілісне), знежирене (зняте) та молозиво. Жирне молоко попередньо знежирюють відстоюванням або центрифугуванням, потім з-під вершкового шару забирають молоко для дослідження. Знежирене молоко та молозиво досліджують без попередньої підготовки, але так, щоб вершків потрапила мінімальна кількість.
Знежирене молоко наносять на скло (чашку Петрі) у кількості 0,1 мл (або двох крапель) та 0,05 мл (або однієї краплі). До кожної дози випробуваного молока додають по одній краплі бруцельозного діагностикуму. Реакція супроводжується двома контролюми: до 0,05 мл діагностикуму додають 0,1 мл фізіологічного розчину та 0,1 мл випробуваного молока змішують з 0,05 мл 12% розчину хлористого натрію. Шляхом похитування скла змішують інгредієнти. Облік реакції проводять у перші 3-5 хв.
Позитивна реакція аглютинації характеризується випаданням пластівців з більшим або меншим знебарвленням молока. При негативному результаті молоко залишається рівномірно забарвленим у блакитний колір (колір антигену).
Дослідження молочної сироватки
Перед отриманням молочної сироватки жирне молоко знежирюють центрифугуванням або відстоюванням. Молочну сироватку одержують при створаженні молока сичужним ферментом. Для цього до 5 мл молока додають 1-2 краплі 10% сичужного ферменту на фізіологічному розчині натрію хлористого. Пробірки поміщають за нормальної температури 37 °З 20-30 хв (до згортання молока). Молочну сироватку можна отримати шляхом приміщення молока при 37 °С на добу. Молочну сироватку відразувідокремлюють шляхом фільтрування через паперовий фільтр. Подальші маніпуляції: постановка реакції та облік результатів аналогічно постановці та обліку реакції аглютинації з незбираним молоком.
При оцінці результатів дослідження молока на бруцельоз за допомогою пластинчастої реакції аглютинації необхідно врахувати можливість утворення дрібнохлопчастого аглютинату, який через каламутність молока може бути не відмічений і результати реакції можуть бути прийняті за негативні. У негативних реакціях рекомендується молоко досліджувати у реакції аглютинації із молочною сироваткою.