Спосіб адаптивної імунотерапії
Винахід відноситься до медицини, використовується, зокрема, при лікуванні хворих на гнійно-септичні процеси. Сутність винаходу: при способі адаптивної імунотерапії виділення мононуклеарних клітин проводять у два етапи, на першому з яких отримують лейковзвесь, а на другому - з лейковзвесі виділяють мононуклеарні клітини; эритроциты подвергают двукратной процедуре отмывания и модифицируют путем связывания с комбинацией цитокинов, после чего возвращают их обратно пациенту, причем при наличии гнойной полости перед введением пациенту культивированных с интерлейкином-2 мононуклеарных клеток, гнойную полость промывают раствором, содержащим комбинацию цитокинов, полученных при культивировании мононуклеарных клеток з інтерлейкіном-2.
Винахід відноситься до медицини, а саме до способів адаптивної імунотерапії, особливо при лікуванні хворих з поширеними гнійно-септичними процесами: гнійний перитоніт, розлитий, сепсис, нагноєльні захворювання легень або їх комбінації.
Відомий спосіб (PCT N 89/04665, кл. А 61 До 37/02, 1989 р.) лікування інфекційних захворювань у дітей, що викликаються основною імунологічною недостатністю клітинної імунної функції в організмі, при якому дитині призначають імунотерапевтично активну ефективну кількість інтерлейкіну-2 ( ІЛ-2).
Відомий спосіб використання ІЛ-2 при вакцинації осіб з ослабленою імунологічною резистетністю вроджених аутоімунних хвороб (патент Німеччини N 3818054, кл. А 61 К, 1989). За цим способом використовують комбінацію ІЛ-2 з антигенами або вакцинами для превентивного або терапевтичного відновлення ослабленої імунологічної резистентності.
Відомий також метод лікування інфекційних хвороб комбінацією ІЛ-2 та імуноглобулінів людини (патент Німеччини N3818055, кл. А 61 До 37/02, 1989).
Відомий також спосіб лікування з використанням тільки ІЛ-2 при розширених бактеріальних інфекціях (патент Німеччини N 3910011, А 61 К 37/02, 1990). За цим способом введення ІЛ-2 внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньочеревно, внутрішньом'язово призводить до посилення неспецифічної клітинної відповіді, що сприяє зниженню числа бактерій у перитонеальній порожнині та зниженню ендотоксинів у плазмі крові. Спосіб за патентом може бути використаний шляхом введення ІЛ-2 у дозі 1-3,510 6 ОД/кг у післяопераційному періоді, станах після тяжкої травми, поширеної грампозитивної та грамнегативної інфекції, перитоніті, імунодепресивних станах.
Однак використання високих доз ІЛ-2 може викликати розвиток токсичних реакцій та є надзвичайно дорогим.
Відомий спосіб адаптивної імунотерапії при лікуванні деяких онкологічних захворювань [1] саме, метастазує меланоми і раку нирки, що полягає в заборі крові у пацієнта, виділенні мононуклеарних клітин, культивуванні їх з ІЛ-2 і поверненню пацієнту. Забір крові та виділення популяції мононуклеарних клітин (МНК) здійснюють на сепараторі клітин крові (прилад "Blond cell separator"). Еритроцити одразу повертають у кров пацієнтові. МНК у концентрації- 1-2 o 10 6 кл/мл культивують з ІЛ-2 у дозі 1000 ОД/мл протягом 2-5 діб. Потім МНК разом із інфузіями високих доз ІЛ-2 повертають пацієнту. Інкубація МНК з ІЛ-2 призводить до генерації лімфокін-активованих кілерів, здатних вбивати пухлинні клітини.
Недоліками методу є обмеженість сфери використання (ефективність у вигляді 25% клінічної відповіді реєструється лише при меланомі та раку нирки), токсичність високих доз ІЛ-2 та дорожнеча методу.
Завданням винаходує розширення сфери використання, підвищення ефективності, зниження собівартості методу.
Завдання вирішується у винаході тим, що в способі адоптивної імунотерапії, що полягає в заборі крові у пацієнта, виділенні мононуклеарних клітин, культивуванні їх з ІЛ-2 і поверненні пацієнту, виділення мононуклеарних клітин проводять у два етапи, на першому з яких отримують лейковзвесь, а другому з лейковзвесі виділяють мононуклеарні клітини; еритроцити піддають дворазовій процедурі відмивання і модифікують шляхом зв'язування з комбінацією цитокінів, після чого повертають назад пацієнту, причому при наявності гнійної порожнини перед введенням пацієнту культивованих з ІЛ-2 мононуклеарних клітин порожнину промивають розчином, що містить комбінацію цитокінів .
У стерильний флакон вводять 7,5 тис ОД гепарину, забирають 300-400 мл венозної крові хворого, додають 20% розчину желатинолю і інкубують 45 хв при 37 o C. Лейковзвесь збирають в окремий флакон, центрифугують при 1000 об/хв нестача. Клітини лейковзвеси ресуспендують у фосфат-забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) і центрифугують у градієнті щільності фіколла-верографіну при 3000 об/хв 20 хв. Після чого клітини інтерфази (МНК) збирають і триразово відмивають Р. Виділення МНК ресуспендують у повному культуральному середовищі RPMI-1640, доповненому 5% сироватки донорів IV (AB) групи, доводять до концентрації 210 6 кл/мл і культивують у скляних матраца -2 у дозі 50-100 ОД/мл протягом 48 год. Потім клітини одноразово відмивають ЗФР, ресуспендують у 100 мл фізіологічного розчину та вводять пацієнту. еритроцити, що залишилися у флаконі (після забору лейковзвесі), одноразово відмивають фізіологічним розчином і модифікують шляхом інкубації.протягом 1 години при 37 o C з розчином, що містить комбінацію цитокінів, у присутності біологічно прийнятного фіксатора. Після інкубації еритроцити одноразово відмивають фізіологічним розчином, доводять до вихідного об'єму крові фізіологічним розчином та повертають пацієнтові. У хворих з наявністю гнійних порожнин (абсцеси, плеврит, перитоніт) перед введенням ІЛ-2-активованих МНК порожнину промивають розчином, що містить комбінацію цитоксинів.
Приклад 1. Чоловік, 43 роки. Вступив до 3 хірургічного відділення Муніципальної клінічної лікарні N 12 11.04.94 р. з діагнозом гострий апендицит, дифузний перитоніт.
11.04.94 р. операція: лапаротомія, дренування сальникової сумки, холецистостомія, дренування черевної порожнини. У черевній порожнині велика кількість серозно-геморагічного випоту: підшлункова залоза тотально уражена набрякла, багряного кольору.
Хворому проводили антибактеріальну, дезінтоксикаційну, антиферментну терапію, плазмоферез, форсований діурез, нейровегетативні блокади в епідуральний простір.
Незважаючи на інтенсивну терапію, стан хворого залишався важким: млявість, загальмованість, блідість шкірних покривів, вологий язик, помірно болючий живіт без чітких перитональних симптомів, нудота, блювання, поганий апетит, гіпертермія до 38,5 o C, тверде хрипами. У крові токсична зернистість нейтрофілів, токсична анемія, висока дистаза сечі.
Нагноєння післяопераційної рани, розплавлення жирової клітковини соком підшлункової залози, розбіжність апоневрозу протягом післяопераційної рани.
Діагноз: гострий жировий панкреонекроз.
Ускладнення: панкреатичний свищ, що формується. Розливний сірчано-геморагічний перитоніт.Колібактеріальний сепсис. Двостороння пневмонія. Велика рана черевної порожнини.
Від лікування, що проводиться, позитивної динаміки немає. Імовірність летального результату висока. Адаптивна терапія розпочата 04.05.94 р. Одноразова гемоексфузія (400 мл крові), в день гемоексфузії введення модифікованих аутоеритроцитів та 06.05.97 р. внутрішньовенна інфузія ІЛ-2-активованих М К (65010 6 клітин Перед інфузією ІЛ-2-активованих МНК проведено перфузію черевної порожнини розчином, що містить комбінацію цитокінів.
Через 3-4 дні після проведеної АІТ нормалізувалася температура тіла, з'явився апетит, хворий став активним, лапаростомна рана почала швидко очищатися та заповнюватись грануляціями. За лабораторними аналізами: зменшилася анемія, зникла токсична зернистість, нормалізувався загальний білок крові, амілаза крові, дистазу сечі. З 10.05.94 р. посіви крові стерильні (до цього висівали E.Coli).
У подальшому хворий адекватно реагував на всю терапію, що проводиться. 03.06.94 р. виписаний у задовільному стані (сформований навколопанкреотичний свищ, чиста серединна рана з активною крайовою епітелізацією та яскравими грануляціями). Надбавка у вазі, гарний апетит, явища пневмонії купіровані.
Приклад 2. Чоловік, 45 років, вступив до 3 хірургічного відділення Муніципальної клінічної лікарні № 12 19.12.93 р. з діагнозом: абсцедуюча пневмонія праворуч, піопневмоторакс праворуч.
Рентгенологічно: рівень рідини до 1 ребра, середостіння різко зміщено вліво. Права легеня колабірована майже повністю.
Лабораторно: анемія, лейкоцитоз, висока ШОЕ.
Виконано плевральну пункцію, дренування плевральної порожнини з активною аспірацією (близько 2 л гнійної рідини), проводиться антибактеріальна, інфузійна, дезінтоксикаційна тафізіотерапія). 24.12.93 р. розтин флегмони грудної стінки, сформувалася гнійна порожнина. Стан хворого залишався тяжким: температура тіла 38-39 o C, частий кашель з харкотинням.
31.12.93 р. розтин флегмони, дренування гнійної порожнини, післяопераційний період ускладнився інфекційно-токсичним шоком.
Інтенсивна терапія в умовах РВ.
03.01.94 р. погіршення стану (болі в животі, нудота, блювання, сухість у роті), обумовлене проривом гнійника з плевральної в черевну порожнину з розвитком перитоніту.
04.01.94 р. лапаротомія, санація, дренування черевної порожнини (близько 1 л гнійного ексудату), плевроторакальний свищ праворуч. У п/операційному періоді прогресуючий перитоніт, щодо чого неодноразово проводилися санації черевної порожнини. У хворого зберігається анемія, гіпопротеїнемія, виражена інтоксикація.
Клінічна картина сепсису.
13.01.94 відбулася евентрація петель тонкого кишечника.
14.01.94 р. лапаротомія. Стан хворого залишається стабільно тяжким.
Діагноз: Пневмонія, що абсцедує праворуч. Піопневмоторакс праворуч. Флегмона грудної клітки праворуч.
Ускладнення: емпієма плеври, плевроторакальна нориця праворуч, розлитий гнійно-фібринозний перитоніт, підпечінковий абсцес, евентрація петель тонкого кишечника.
Ефективності від лікування немає. Імовірність летального результату висока.
Адоптивна імунотерапія розпочато 18.01.94 р. Проведено 2 процедури гемоексфузії (по 250 мл крові), ремнфузія модифікованих аутоеритроцитів у дні забору крові та повернення ІЛ-2-активованих МНК (1,310 9 і 31010). Перед введенням ІЛ-2-активованих МНК проведена перфузія плевральної та черевної порожнин розчином, що містить комбінацію цитокінів.
Після проведеної терапії стан хворого покращився: зменшилася інтоксикація, дихальна недостатність, розв'язався парез кишечника, відзначається швидка позитивна динаміка протягом ранового процесу на грудній стінці (рана активно гранульована, значно скоротилася гнійна порожнина).
22.01.94 р. етапна санація черевної порожнини, зашивання черевної стінки. Післяопераційний період без ускладнень.
22.02.94 р. виписаний у задовільному стані з поверхневими гранулюючими ранами.
Приклад 3. Жінка, 52 роки. Надійшла до 3 хірургічного відділення Муніципальної клінічної лікарні N 12 22.04.94 р. з діагнозом: остеомієліт головки лівої стегнової кістки, коксит лівого тазостегнового суглоба.
Призначено консервативну терапію (антибіотики, вітаміни, фізіолікування). Незважаючи на лікування, що проводиться, хворий погіршується, приєдналася двостороння пневмонія, наростає інтоксикація.
29.04.94 р. переведено до палати інтенсивної терапії.
30.04.94 р. артротомія, розтин параатикулярної флегмони (видалено близько 500 мл гнійного ексудату).
Післяопераційний діагноз: гнійний коксит зліва, остеомієліт головки та шийки лівої стегнової кістки, параартикулярна флегмона лівого тазостегнового суглоба. Стафілококовий сепсис.
Адоптивна імунотерапія розпочато 04.05.94 р. Гемоексфузія (400 мл крові), реінфузія модифікованих аутоеритроцитів та 06.05.94 р. введення ІЛ-2-активованих МНК.
Через 2 тижні процедуру повторили. Після першої процедури зазначено: зменшення кількості відокремлюваного з рани; відокремлюване стало набувати серозного характеру. На 6-7 добу перестали турбувати біль у рані, нормалізувалася температура тіла. На 10 добу відмічено появу грануляцій, крайову епітелізацію.
Після повторної процедури АІТ хвора стала активною, рана і ранова порожнина значно скоротилися в розмірах, що відокремлюється з рани немає. Посіви крові стерильні.
23.06.97 р. хвора виписана в задовільному стані з ранами, що гояться.
Далі представлені порівняльні дані щодо відсотка летальності при проведенні лікування за запропонованим способом та традиційним методом.
Група хворих Летальність Усього (n-24) 16% (4/24) Дані літератури * 28-49% * Стручков В.І. Гостищев В.К. Стручков Ю.В. Посібник з гнійної хірургії / АМН СРСР М. Медицина, 1984. 512 з.
З цих даних видно, що ефективність запропонованого способу суттєво вища, ніж при використанні традиційних схем терапії гнійно-септичних хворих (антибактеріальна, дезінтоксикаційна, інфузійна тощо).
Спосіб адаптивної імунотерапії, що полягає в заборі крові у пацієнта, виділенні мононуклеарних клітин, культивуванні їх з інтерлейкіном-2 і поверненні їх пацієнту, який відрізняється тим, що виділення мононуклеарних клітин проводять у два етапи, на першому з яких отримують лейковзвесь, а на другому з лей виділяють мононуклеарні клітини, еритроцити піддають дворазовій процедурі відмивання і модифікують шляхом зв'язування з комбінацією цитокінів, після чого повертають їх назад пацієнту, причому при наявності гнійної порожнини перед введенням пацієнту культивованих з інтерлейкіном-2 мононуклеарних клітин гнійну порожнину культивування мононуклеарних клітин з інтерлейкіном-2