Спосіб діагностики гемофільної інфекції (hemophilus influenzae)
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема мікробіології, а саме виявлення експресії капсульного антигену Hemophilus influenzae "b" в тканинах органів. Спосіб забезпечує спрощення діагностики Hemophilus influenzae "b" шляхом виявлення рибозилрибітолфосфату - антигену Hemophilus influenzae "b" за допомогою модифікованого непрямого імунопероксидазного методу в тканинних структурах органів для можливого його застосування в практичній охороні здоров'я та оцінки тяжкості течії. Проводять непрямий імунопероксидазний метод, при цьому гістологічні парафінові зрізи біопсійного та аутопсійного матеріалу витримують у 3-х порціях ксилолу по 15 хв у кожній при температурі 60 o С, обробляють 0,3% Тритоном Х-100, наносять поліклональні кроличі. і наносять антивидовий кон'югат HRP, інкубують і фарбують, після чого проводять мікроскопічне дослідження і за наявності коричневих гранул внутрішньоклітинно та на клітинній оболонці діагностують гемофільну інфекцію. 2 іл.
Даний винахід відноситься до галузі медичної діагностики, зокрема виявлення Hemophilus influenzae.
Останні два десятиліття відзначалися високі підйоми гемофільних менінгітів.
За даними ВООЗ рівень захворюваності на гемофільний менінгіт у розвинених країнах знижується, а в країнах колишнього СРСР Азії, Африки та Латинської Америки відзначається різке піднесення.
Відомим способом виявлення гемофільної палички є бактеріологічна діагностика (Наказ М3 Україна 375 від 23.12.98р. "Про заходи щодо посилення епідеміологічного нагляду та профілактики менінгококової інфекції та гнійних бактеріальних менінгітів").
1-й день дослідження.
1. Спіномозковурідину (1,0 мл) забирають стерильною пастерівською піпеткою з дна пробірки і по 2-3 краплі засівають на поверхню 2-х чашок Петрі з підігрітим живильним середовищем (1 чашка "шоколадний" агар, 2 чашка сироватковий).
2. Інкубують при температурі 37 o З при підвищеному вмісті СО2, 24години.
3. Приготування мазків.
4. Забарвлення мазків за Грамом.
5. Мікроскопія мазків.
2-й день дослідження.
1. Перегляд чашок візуально та за допомогою бінокулярного стереоскопічного мікроскопа, лупи МБС.
2. Приготування мазків-препаратів.
3. Забарвлення мазків за Грамом.
4. Мікроскопія мазків.
3-й день дослідження.
Ідентифікація гемофілів: 1. серотипування 2. визначення біовара Цей метод дозволяє отримати добрі результати. Однак існують обставини, що знижують його ефективність: він займає багато часу (3-4 діб), трудомісткий і для отримання результатів потрібні дорогі живильні середовища та реагенти.
Найбільш близьким до пропонованого нами способу є метод імуноферментного аналізу (ELISA) для антигену Hemophilus influenzae "b" у лікворі, запропонований Roggen, E.L, R. Pansaerts, E. Van Dyck, and Piot. 1993 (Journal Clin. Microbiol. 31.1820-1825).
1. Відцентрифуговану та відфільтровану спиномозкову рідину фіксують на 1% бичачому сироватковому альбуміні у спеціальних планшетах при кімнатній температурі.
2. Обробляють 2% баранячої сироваткою на карбонатному буфері з рН 9 за кімнатної температури.
3. Промивають у карбонатному буфері з рН 7,5.
4. Наносять кролячу сироватку проти антигену Hemophilus influenzae "b".
5. Наносять та інкубують при кімнатній температурі з кон'югатом антикролячих IgG.
6. Обробляють О-фенілендіаміном зперекисом водню у цитратному буфері з рН 5.
Врахування результатів реакції проводиться в стандартному спектрофотометрі при довжині хвилі 490-600 нм.
Технічний результат винаходу полягає у спрощенні способу діагностики гемофільної інфекції шляхом виявлення антигену гемофільної палички (Hemophilus influenzae "b"), який відрізняється тим, що капсульний антиген гемофільної палички (рибозилрибитолфосфат) визначають непрямим імунопероксидом. 3-х порціях ксилолу, по 15 хв у кожній, при температурі 60 o С, перед нанесенням першої сироватки, обробляють 0,3% Тритоном Х-100, як антивидовий кон'югат використовують DAKO En Vision+System, HRP, і наявність позитивного фарбування у вигляді коричневих гранул при мікроскопічному дослідженні свідчить про виявлення гемофільної інфекції для можливого його застосування у практичній охороні здоров'я, оцінки тяжкості перебігу інфекційного захворювання та своєчасного призначення патогенетичної терапії.
Стандартну схему непрямого імунопероксидазного методу описано Дж. Полак, С. Ван-Норден. Введення в імуноцитохімію, М., "Мецицина", 1986р.
1 - промивання зрізів у буфері, 2 - обробка 0,03% розчином перекису водню, 3 - промивання в буфері, 4 - нанесення на зріз перших специфічних антитіл, 5 - промивання в буфері, 6 - нанесення других антитіл, пов'язаних з пероксидазою, 7 - промивка в буфері, 8 - обробка 0,03% розчином диаминобензидина (ДАБ), 9 - дофарбування гематоксиліном, 10 - укладання в бальзам. Мікроскопія.
Але як свідчать дані літератури та власний досвід, наведена схема лише у вигляді відбиває хід постановки методики. Залежно від розмірів, структури та природи антигену, що виявляється, необхіднадетальна розробка всіх етапів, починаючи з фіксації до нанесення диаминобензидина.
В рамках пропонованого способу вперше запропонована депарафінізація гістологічних зрізів у трьох порціях ксилолу при температурі 60 o С, що сприяє підвищенню проникності клітинних мембран, усунення зшивок між білками. Після такого впливу антиген стає більш доступним для антитіл, що є необхідною умовою їхньої взаємодії. Зміна умов депарафінізації від встановлених величин не рекомендується, оскільки в цьому випадку антиген залишається недоступним антитіл і порушується повнота його виявлення.
Одна із складних проблем – це наявність у сироватці забруднених антитіл. Очищення сироватки призводить до зниження її авидності. Значне розведення специфічної сироватки також небажано, оскільки подовжує час проведення реакції, може знизитися концентрація антигену, що виявляється. Для усунення цих недоліків нами запропоновано обробку мазків 0,3% Тритон Х-100 протягом 15 хв при температурі 37 o С, яка передує нанесенню першої сироватки. Детергент, що використовується, адсорбує забруднені антитіла, значною мірою усуваючи неспецифічне фарбування. Крім вищезгаданого, ТритонХ-100 підвищує проникність клітинних мембран, сприяючи проникненню антитіл, що використовуються в клітину.
Використання антивідових антитіл DAKO En Vision+System, HRP, знизило кількість неспецифічного фарбування, оскільки мічений полімер не містить авідин або біотин, отже, неспецифічне фарбування при взаємодії авідину з ендогенним біотином в органах виключається.
Запропонований вперше новий спосіб виявлення Hemophilus influenzae "b" та комплекс методичних прийомів, що виконуються в процесіімунопероксидазного виявлення капсульного антигену Hemophilus influenzae "b" (рибозилрибітолфосфат) є необхідним. Невиконання останніх не дає об'єктивних результатів або спотворює кінцевий результат досліджень, що не дозволяє провести відповідну інтерпретацію отриманих даних.
Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: 1. Гістологічні парафінові зрізи тканин депарафінізують у трьох порціях ксилолу по 15 хв у кожній за температури 60 o С.
2. Промивають у фосфатно-сольовому буфері (рН 7.2-7.4) протягом 3-4 хв.
3. Обробляють 0,1% розчином Трипсину 0,1% CaCl2 протягом 20 хв.
4. Обробляють 0,03% перекисом водню протягом 20 хв.
5. Промивають у двох порціях фосфатно-сольового буфера (рН 7.2) по 6 хв у кожній.
6. Інкубують у 0,3% Тритон Х-100 при температурі 37 o С протягом 15 хв.
7. Наносять поліклональні кролячі антитіла до рибозилрибітолфосфату (любовно надані проф. Костюкової Н.М., інститут Гамалея). Інкубують з поліклональними антитілами при температурі 37 o С протягом 45 хв.
8. Промивають у воді протягом 5 хв.
9. Промивають у двох порціях фосфатно-сольового буфера (рН 7.2) по 5 хв у кожній.
10. Наносять антивидовий кон'югат DAKO Еn Vision+System, HRP, і інкубують протягом 45 хв у темній камері при кімнатній температурі.
11. Промивають у двох порціях фосфатно-сольового буфера (рН 7.2) по 5 хв у кожній.
12. Обробляють матеріал у водному розчині, що містить 0,05% 3,3-діамінобензидин тетрахлориду (ДАВ) та 0,025% перекису водню протягом 3 хв.
13. Слабо дофарбовують гематоксиліном.
Мікроскопію пофарбованих препаратів проводять у звичайному мікроскопі. Продукт реакції при дослідженні тканинних структур,містять Hemophilus influenzae "b", виявляється у вигляді коричневих гранул внутрішньоклітинно і на клітинній оболонці. При оцінці даних мікроскопічного дослідження важливо враховувати виникнення артифікаційних змін, що імітують позитивне забарвлення. Найчастіше – це клітинні артефакти, що виявляються по краю препарату. У цьому випадку необхідно оцінити реакцію на сусідніх ділянках.
Для отримання достовірних результатів та виключення можливості неспецифічних реакцій обов'язковою умовою є проведення контролю на якість реактивів та специфічність антисироватки.
1) Для проведення контролю специфічності антисироватки як перший шар наносять неімунну сироватку або буфер (результати повинні бути негативними).
2) Неспецифічність сироватки усувають за допомогою максимального розведення висококонцентрованої сироватки та скорочення часу інкубації.
Описаний спосіб підкріплений прикладами конкретного виконання: Було проведено дослідження аутопсійного матеріалу 15 померлих в гострий період гемофільної (викликаної Hemophilus influenzae - b) інфекції, у 12 з них була виявлена експресія капсульного антигену Hemophilus influenzae". У трьох випадках, коли експресія рибозилрибітолфосфату не визначалася, при подальшому бактеріологічному дослідженні аутопсійного матеріалу було встановлено пневмококову етіологію захворювання.
Як приклад наводимо мікрофотографії тканини і оболонок головного мозку з чітко визначеною експресією капсульного антигену Hemophilus influenzae "b" хворої на Буркову Марію, 2 роки 10 міс, N історії хвороби 3316 від 13.05.99г. , з гемофільною інфекцією в гострій фазі тяжкого перебігу захворювання (див. фіг. 1 та 2).
Таким чином, запропонований спосіб дозволяє з високим ступенемспецифічності та достовірності виявити експресію капсульного антигену Hemophilus influenzae "b"(рибозилрибітолфосфат) у тканинах органів.
Метод досить простий, можливе його широке застосування в практичній охороні здоров'я для швидкого визначення Hemophilus influenzae "b" у тканинах органів та, відповідно, оцінки тяжкості перебігу захворювання та своєчасного призначення патогенетичної терапії.
Пропонований метод має економічну значимість, т.к. при цьому не потрібне застосування додаткового лабораторного обладнання.
Спосіб діагностики гемофільної інфекції шляхом виявлення антигену гемофільної палички Hemophilus influenzae "b", який відрізняється тим, що визначають непрямим імунопероксидазним методом капсульний антиген Hemophilus influenzae "b" рибозилрибітолфосфат, при цьому гістологічні парафін 15 хв у кожній, при температурі 60 o С, обробляють 0,3% Тритоном Х-100, наносять поліклональні кролячі антитіла до рибозилрибітолфосфату, промивають і наносять антивидовий кон'югат HRP, інкубують і фарбують, після чого проводять мікроскопічне дослідження і при наявності коричневих гранул всередині оболонці діагностують гемофільну інфекцію