Спосіб діагностики лептоспірозу сільськогосподарських тварин
Власники патенту UA 2493569:
Винахід відноситься до ветеринарії. Спосіб діагностики лептоспірозу сільськогосподарських тварин, що включає визначення наявності антитіл до антигенів семи серогруп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe і L.icterohaemorrhagiae в сироватці крові , що як антиген застосовують змішані в рівних кількостях антигенні білки з лептоспір трьох серогруп - L.tarassovi, L.grippotyphosa і L.hebdomadis. Винахід значно спрощує та максимально скорочує діагностику лептоспірозу, дозволяє здійснювати оперативний контроль за епізоотичним станом тварин за лептоспірозом. Спосіб має високу специфічність, чутливість і стандартність, а також забезпечує створення безпечних умов праці для персоналу діагностичних лабораторій. 4 табл., 4 ін.
Винахід відноситься до ветеринарії, а саме до діагностики інфекційних захворювань та може бути використане для діагностики лептоспірозу у сільськогосподарських тварин.
Відомий спосіб діагностики лептоспірозу, заснований на використанні реакції мікроаглютинації - РМА (ГОСТ 25380-91. Тварини сільськогосподарські. Методи лабораторної діагностики лептоспірозу. - Натомість ГОСТ 325386-82; введ. 1993-01-01. - М. 1992. – 30 с.), який здійснюється шляхом додавання лептоспірозної культури до досліджуваної сироватці крові тварини з подальшим визначенням титрів лептоспірозних антитіл. Як антигени для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові тварин у РМА використовують живі культури лептоспір. При цьому обов'язковим є використання при плановому дослідженні лептоспірозу кожної сироватки крові мінімумсеми антигенів (живих лептоспір серогруп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe, L.icterohaemorrhagiae). Діагностичні штами лептоспір лабораторії підтримують періодичними пересіваннями кожні 10-15 днів. У реакції використовують культури лептоспір у віці 5-10 днів без ознак аглютинації та лізису з накопиченням мікробних клітин 50-100 млн/см3.
Однак відомий спосіб має суттєві недоліки: велика трудомісткість, суб'єктивна оцінка результатів діагностики, неможливість стандартизації проведення діагностики, необхідність обліку реакції лише під мікроскопом. Крім того, спосіб вимагає постійного підтримування у стабільному стані повного діагностичного набору живих лептоспірів, що може загрожувати здоров'ю персоналу ветеринарних лабораторій.
За прототип прийнятий спосіб виявлення лептоспірозних антитіл у сироватці крові свиней за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), де для виготовлення антигену використовують лептоспіри 7-ми серогруп: L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.ca. L.sejroe, L.icterohaemorrhagiae (див. Патент Україна №2053513, МПК A61K 39/00 від 27.01.96.). Однак цей спосіб трудомісткий, т.к. для отримання антигену необхідно використовувати лептоспіри 7-ми серогруп і при цьому даний спосіб не призначений для виявлення лептоспірозних антитіл в інших видів сільськогосподарських тварин.
Завданням винаходу є розширення арсеналу способів діагностики лептоспірозу, що забезпечує в короткі терміни з максимальною точністю та об'єктивністю отримання результатів, що свідчать про наявність у досліджуваних сироватках крові сільськогосподарських тварин антитіл до патогенних лептоспірів, а також безпечні умови праці для персоналудіагностичних лабораторій
Поставлене завдання вирішується тим, що в способі діагностики лептоспірозу сільськогосподарських тварин, що включає метод непрямого твердофазного ІФА для виявлення антитіл до антигенів семи серогруп L.hebdomadis, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.sejroe .icterohaemorrhagiae в сироватці крові, згідно винаходу, як антиген застосовують змішані в рівних кількостях антигенні білки з лептоспір трьох серогруп - L.tarassovi, L.grippotyphosa і L.hebdomadis. Цей спосіб дозволяє виявляти лептоспірозні антитіла у різних видів сільськогосподарських тварин.
Спосіб здійснюється наступним чином.
Отриманим антигеном сенсибілізують полістиролові планшети для ІФА протягом 16-18 год при 20-22°C, з наступним нашаровуванням 1% розчину БСА з експозицією в 1 год при 37°C і подальшим триразовим промиванням.
У дві лунки планшета вносять по 100 мкл позитивного контрольного зразка (К+), дві інші лунки планшета - по 100 мкл негативного контрольного зразка (К-). В інші лунки планшета вносять по 50 мкл розводящого буферного розчину для сироваток (РБР-С) і по 50 мкл досліджуваних сироваток. Розчин перемішують 5 разів піпетуванням, не торкаючись дна лунки.
Після внесення проб сироваток планшет поміщають у пластиковий пакет або накривають кришкою та інкубують 60 хвилин при 37°C. Після інкубації лунки звільняють від вмісту та п'ятиразово промивають робочим фосфатно-сольовим буферним розчином з твіном (ФСБ-Т).
Після промивання лунки планшета вносять по 100 мкл розчину кон'югату, кон'югованого з пероксидазою хрону (РКг-G); планшет поміщають у пластиковий пакет або накривають кришкою та витримують 30 хвилин при 37°C.
Після повторної інкубації лунки звільняють відвмісту та проводять п'ятикратне промивання робочим розчином ФСБ-Т. Після промивання в лунки планшета вносять по 100 мкл розчину хромоген-тетраметилбензидин субстрату (ТМБ-субстрат) та витримують 30 хвилин при 37°C у темряві. Після закінчення зазначеного часу реакцію зупиняють додаванням у кожну лунку по 50 мкл стоп-розчину.
Оцінка результатів реакції:
Результати ІФА реєструють на спектрофотометрі. Оптичну густину (ОП) вимірюють при довжині хвилі 450 нм. Нульовий рівень («бланк») задають повітрям. Розраховують ОПкрит. за формулою:
де ОПК-(СР) - середнє значення ВП (ОПК-) по двох лунках.
Якщо значення оптичної щільності досліджуваного зразка не перевищує ОПкрит., то зразки розглядаються як негативні на наявність лептоспірозних антитіл до серогруп L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe і L.sejroe.
Якщо значення оптичної густини досліджуваного зразка перевищує ОПкрит., то зразки розглядаються як позитивні на наявність лептоспірозних антитіл до серогруп L.pomona, L.tarassovi, L.hebdomadis, L.icterohaemorrhagiae, L.grippotyphosa, L.sejroe і L. поєднанні.
Приклад 1. Визначали оптимальне поєднання антигенних білків різних серогруп лептоспіру при отриманні антигену.
Для цього використовували окремо антигенні білки кожної з 5-ти серогруп лептоспір (антигенні білки серогруп L.canicola і L.sejroe окремо не брали для дослідження, тому що вони мають антигенну структуру ідентичну з L.icterohaemorrhagiae і L.hebdomadis відповідно), а також змішані в рівних кількостях антигенні білки семи серогруп.
- №1 антигенні білки L.hebdomadis,
- №2 антигенні білки L.pomona,
- №3 антигеннібілки L.tarassovi,
- №4 антигенні білки L.icterohaemorrhagiae,
- №5 антигенні білки L.grippotyphosa,
- №6 антигенні білки L.hebdomadis+L.pomona+L.tarassovi+L.grippotyphosa+L.canicola+L.sejroe+L.icterohaemorrhagiae - полівалентний антиген.
Для дослідження ІФА з виготовленими антигенами використовували сироватки крові кроликів, сенсибілізованих культурами лептоспір різних серогруп. Попередньо сироватки крові досліджували у РМА. Як контроль специфічності використовували сироватку крові інтактних кролів з негативною РМА на лептоспіроз (табл.1).
Результати досліджень, наведені в таблиці №1, показують, що при дослідженні сироваток крові інтактних кроликів з різними антигенами в ІФА у всіх випадках отримали негативні результати, які збіглися з РМА.