Спосіб отримання гомозиготних диплоїдів сільськогосподарських культур
Використання: біотехнологія, сільське господарство, селекційно-генетичні дослідження. Сутність винаходу: гомозиготні диплоїди отримують шляхом кастрації квіток, обробки їх аломиктическим агентом, що є водним розчином суміші гібереліну і цитокініна, і подальшого вирощування рослин. 2 з.п. ф-ли, 6 табл.
Винахід відноситься до сільського господарства, зокрема генетики та селекції рослин, і може бути використане для отримання гомозиготних диплоїдів, що виникають в результаті індукованого нерегулярного апоміксису.
Нерегулярний апоміксис є природним явищем, що полягає в розвитку зародка з яйцеклітини або іншої клітини зародкового мішка за відсутності запилення. Такий тип апоміксису, що зустрічається в природі досить рідко (110-6), називається партеногенез або апогамія. Останніми роками багатьма дослідниками вишукуються методи індукування нерегулярного апомиксиса у найважливіших сільськогосподарських культур на вирішення селекційних програм.
Відомий спосіб отримання гомозиготних диплоїдів м'якої пшениці, що включає ідентифікацію гаплоїдних і диплоїдних апоміктів по фарбуванню колеоптилю і числу хромосом, кастрацію квіток внутрішньовидових гібридів пшениці, їх запилення пилком того ж виду, обробленим 0, 18 год і при температурі повітря 20 про С в колосках, зрізаних на стадії одноядерного і двоядерного пилку [1] Недоліком відомого способу є тривалий і трудомісткий шлях для широкого впровадження в селекційному процесі зважаючи на необхідність попереднього приготування инактивированной. До того ж не весь пилок інактивується, що призводить до зав'язування гібридних зародків, тим самим затягує і ускладнює відбір. Спосібвикористовується не на всіх генотипах, а лише з маркерними рецесивними ознаками.
Відомий спосіб отримання гаплоїдів і гомозиготних диплоїдів, що включає обробку рослин під час між мейозом і цвітінням апоміктичним і стерилізуючим агентом на основі похідних з ряду 4-оксо (тіо) нікотинатів або 4-оксо (тіо) циридазинів у кількості 0,03- 1 га [5] Даний спосіб передбачає отримання генетично стійких гаплоїдних та диплоїдних зерен, що використовуються далі в селекції, як джерел чистих гомозиготних ліній.
Однак застосування даного способу недоцільно з екологічних міркувань. Передбачуване за патентом розбризкування хімічних реагентів забруднює повітря і землю не забезпечує отримання гомозиготних диплоїдів з високою достовірністю, так як не весь пилок стерилізується і зав'язуються гібридні зародки, що призводить до проведення додаткових трудомістких операцій з визначення істинних різної плоїдності та гібриди.
Метою винаходу є підвищення частоти утворення гомозиготних диплоїдів та виходу господарсько цінних генотипів рослин.
Це досягається тим, що в якості апоміктичного агента використовується водний розчин суміші фітогормонів гібереліну і цитокініна в кількості 0,01-4 мл на одну рослину, при цьому сумарна концентрація водного розчину суміші фітогормонів коливається в інтервалі 230-694 мкмоль, співвідношення 1 0,75-1,03 при цьому обробку ведуть на стадії зрілого зародкового мішка.
Відмітними ознаками способу є використання в якості апоміктичного агента водного розчину суміші гітобермону фітогормонів і цитокініна у зазначеному співвідношенні, концентраціязастосовуваного розчину, витрати його на одну квітку та фаза розвитку зародкового мішка.
Сукупність суттєвих ознак забезпечує простіший і швидший процес отримання гомозиготних диплоїдів сільськогосподарських культур.
Пропонований спосіб заснований на гормональному індукуванні мітотичного поділу і подвоєння числа хромосом в партеногенетично яйцеклітині, що розвивається, що призводить до отримання абсолютно гомозиготних диплоїдів.
Застосування фітогормонів у сільському господарстві відоме для різних цілей, так, наприклад, відомий спосіб підвищення врожайності фруктів на деревах або інших вегетативних форм кісточкових плодових культур обробкою несучих плодів на гілках під час розвитку плоду 0,01-2%-ним водним розчином суміші містять від 10 до 500 ppm гібереліну, від 10 до 250 ppm ауксину і від 10 до 1000 ppm заміщеної сечовини формули R'N HCO NHR 2 .
Підвищення врожайності в даному випадку досягається за рахунок збільшення кількості плодів і розміру плодів і ягід [2] Відомий спосіб обробки 0,0002-0,4%-ного водного розчину суміші фітогормонів (гібереліну та холіну) для регулювання росту різних рослин [3] обробкою квіток розчином суміші гібереліну і кінетину домагаються прискорення періоду цвітіння хризантем. При цьому оптимальна концентрація водного розчину фітогормонів і співвідношення гібереліліну та цитокініну змінюються.
Так, наприклад, найкращих результатів при отриманні гомозиготних диплоїдів гречки, ячменю та капусти можна отримати при обробці розчиномфітогормонів концентрацією 230-303 мкмоль на 1 л при співвідношенні гібереліліну і цитокініна, що дорівнює 1:0,75-1,03 відповідно.
При отриманні гомозиготних диплоїдів обліпихи та кукурудзи доцільно застосовувати розчин фітогормонів концентрацією 303-694 мкмоль на 1 л при співвідношенні гібереліну та цитокініна, що дорівнює 1:0,75-1 відповідно.
Як гіберелін застосовують промислові марки продукту типу гіберелін А4, А3, А7.
Як цитокініни застосовують промислові марки речовин типу зеатин, зеатин рибозид, кінетин, 6-БАП (6-бензил-амінопурин).
П р і м е р 1. Спосіб здійснюють у такий спосіб. Рано вранці у суцвіть рослин, від яких бажано отримати гомозиготні диплоїди, видаляють квіти, що відцвіли, і бутони, залишаючи тільки ті, які розпустяться в день обробки. З початківців розкриватися бутонів видаляють пильовики, контролюють чистоту кастрації за допомогою лупи та ізолюють за допомогою різних відомих ізоляторів.
На підготовлені таким чином квітки на стадії зрілого зародкового мішка наносять за допомогою мікропіпетки 10 мкл водного розчину суміші гібереліну і кінетину при молярному співвідношенні 1:0,75-1,03 сумарної концентрації 230-694 мкмоль на 1 л. Оброблені рослини притінюють, а суцвіття ізолюють пергаментними ізоляторами. На оброблених суцвіттях видаляють бутони, що знову наростають.
Залежно від виду рослини, від концентрації та співвідношення фітогормонів, що використовуються, частота прояву індукованого нерегулярного апоміксису коливається від 10 до 30% (табл. 1). Результати підтверджують можливість використання водного розчину суміші гібереліну і цитокініну при молярному співвідношенні 1:0,75-1,03 сумарною концентрацією 230-694 мкмоль на 1 л.
П р і м е р 2. На квітки рослин, підготовлені,як описано в прикладі 1, наносять за допомогою мікропіпетки 10 мкл водного розчину гібереліну і зеатину при молярному співвідношенні 1:0,81-1 сумарної концентрації 280-626 мкмоль на 1 л. Як видно з результатів досвіду (табл. 2), при заміні кінетину на зеатин частота прояву індукованого нерегулярного апоміксису майже не змінюється і становить від 23 до 27, як і при використанні кінетину (табл. 1).
П р і м е р 3. На квітки рослин, підготовлені, як описано в прикладі 1, наносять за допомогою мікропіпетки 10 мкл водного розчину гібереліну і 6-бензил-амінопурину (6-БАП) при молярному співвідношенні, що дорівнює 1:0,77 сумарної концентрації 300-600 мкмоль на 1 л. Дані таблиці. 3 дають підставу вважати, що при заміні кінетину на 6-БАП частота прояву індукованого нерегулярного апоміксису дещо знижується, так при обробці гібереліном в суміші з кінетином частота становить 26-28% (табл. 1), а при обробці гібереліном в суміші БАП становить 15-21%. Проте вихід гомозиготних диплоїдів у цьому випадку досить високий.
Результати дослідів, наведені у прикладах 1, 2 та 3, дають підстави вважати, що для індукування нерегулярного апоміксису придатний будь-який цитокінін.
П р і м е р 4. На квітки гречки, підготовлені, як описано в прикладі 1, наносять за допомогою мікропіпетки 10 мкл водного розчину гібереліну і кінетину в різних концентраціях та суміші. Як контроль служить обробка водою, а також обробка квіток гречки водним розчином індивідуального фітогормону.
Як видно з результатів досвіду (табл. 4), індукований нерегулярний апоміксис залежить від концентрації фітогормону та поєднання фітогормонів. Застосування суміші гібереліну та кінетину в сумарній концентрації 285 мкмоль на 1 л у співвідношенні 1:1,03 дає високийвихід гомозиготних диплоїдів, а порівняно з найкращим результатом роздільного застосування фітогормонів є суттєва різниця.
З насіння, отриманого згідно винаходу, були вирощені рослини, пилок яких проаналізували на фертильність реакцій забарвлення розчином йоду калію йодистом. Фертильні пилкові зерна фарбуються повністю, а стерильні не фарбуються зовсім або частково фарбуються. Дані представлені у табл. 5.
Як випливає з представлених даних, у ліній, отриманих даним способом, підвищується фертильність практично до 100% Крім того, у гречки, що володіє самонесумісністю, в результаті індукування нерегулярного апоміксису спостерігався високий ступінь самосумісності, що вплинуло як один з факторів на підвищення врожайності (табл. ). Крім того, лінії відрізняються як від вихідної форми, так і між собою масою 1000 шт. насіння, за плівчастістю та іншими показниками.
Лінії рослин, отримані в результаті індукування нерегулярного апоміксису, відрізняються підвищеною стійкістю до захворювань та несприятливих факторів зовнішнього середовища.
Застосування цього способу дозволяє отримувати чисті гомозиготні лінії за 1-2 роки, долати стерильність у міжвидових гібридів, знижувати витрати на отримання чистих ліній, скорочувати терміни та підвищувати ефективність створення нових сортів.
1. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГОМОЗИГОТНИХ ДИПЛОЇДІВ СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ КУЛЬТУР, що включає кастрацію квіток, обробку їх апоміктичним агентом і подальше вирощування рослин з насіння, що утворюється, що відрізняється, тим, що, з метою підвищення частоти освіти апоміктичного агента використовують водний розчин суміші гібереліну і цитокініна примолярному співвідношенні 1 0,75 1,03 відповідно з сумарною концентрацією речовин 230694 мкМ на 1 л, при цьому обробку ведуть на стадії зрілого зародкового мішка з нормою витрати 0,01 4 мл на одну рослину.
2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що для обробки квіток гречки, ячменю та капусти застосовують водний розчин гібереліну та цитокініна концентрацією 230 303 мкМ на 1 л.
3. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що для обробки квіток обліпихи та кукурудзи застосовують водний розчин гібереліну і цитокініну концентрацією 303 694 мкМ на 1 л при співвідношенні гібереліну і цитокініна 1 0,75 1 відповідно.