Спосіб визначення фракцій ліпопротеїнів крові у хворих на ішемічну хворобу серця.

спосіб

Власники патенту UA 2360256:

Спосіб відноситься до медицини і може бути використаний у кардіології. Спосіб поділу на фракції ліпопротеїнів (ЛП) крові у хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) за допомогою електрофорезу в гелі агарози включає обробку сироватки крові пацієнта протягом 1 год у темряві при 40°С розчином барвника Судану Б, додавання розчину агарози, внесення прогрітої до 55°З суміші в лунку гелю агарози об'ємом 4×20×10 мм, подальшу фіксацію електрофореграм, їх висушування та денситометрування. При цьому перед обробкою Судан Б до 0,3 мл проби сироватки крові пацієнта додатково додають 0,1 мл 0,1% розчину тритону Х-100 і інкубують 15 хв при 20°С. Використання способу дозволяє підвищити чутливість та точність способу за рахунок виявлення мінорних фракцій ліпопротеїнів крові. 3 іл.

Винахід відноситься до галузі медицини і може бути використане в кардіології та терапії.

Відомі способи поділу на фракції ліпопротеїнів (ЛП) крові методом аналітичного ультрацентрифугування крові (А.Н.Клімова, Н.Г.Нікульчева. "Ліпіди, ліпопротеїни та атеросклероз", 1995, Пітер-Прес, с.98-102) та поділу фракції ЛП у поліакриламідному гелі (Н.Н.Шацька "Біохімічні дослідження в оцінці стану серцево-судинної системи." У кн. "Методи досліджень у профпатології", М., 1988, с. 95-97).

Недоліком даних способів є те, що вони не дозволяють виявити всі фракції ЛП крові, включаючи ХМ, ЛПВЩ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ і ЛП (а), а служать для поділу на фракції ХМ, ЛПВЩ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ від комплексу альбуміну з неестеріфікованими жирними кислотами .

Даний спосіб є найбільш близьким до пропонованого за технічною сутністю і досягається результатом і обраний як прототип.

Недоліком способу-прототипу є мала точність, оскільки не дозволяє виявити мінорні фракції ЛП. Це пов'язано з тим, що фракція ЛП(а) є найбільш атерогенною і для ранньої діагностики захворювання особливо важливим є виявлення мінорної фракції ЛП(а), поряд з максимально повним визначенням фракцій інших ЛП крові.

Завданням пропонованого винаходу є підвищення точності та чутливості способу.

Зазначене завдання вирішується поділом на фракції ліпопротеїнів крові у хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) електрофорезом у гелі агарози шляхом обробки проби сироватки крові пацієнта протягом 1 год у темряві при 40°С розчином барвника Судану Б, додавання розчину агарози, внесення прогрітої до 5 З суміші в лунку гелю агарози об'ємом 4×20×10 мм, подальшої фіксації електрофореграм, їх висушування та денситометрування, при цьому попередньо до 0,3 мл проби сироватки крові пацієнта додають 0,1 мл 0,1% розчину тритону Х-100 та інкубують 15 хв при 20°С.

Новим пропонованим винаходом є додаткова інкубація 0,3 мл проби сироватки крові пацієнта з 0,1 мл 0,1% розчину детергенту тритону Х-100 при 20°С протягом 15 хв, що дозволяє виявляти мінорні фракції ЛП крові.

В даний час особлива увага приділяється дослідженню ЛП(а), у зв'язку із чим розробляються способи лабораторної діагностики, що дозволяють досліджувати цей ліпопротеїн крові. Він відноситься до апо-В-містять ліпопротеїни, багатих холестеролом (ХС). ЛП(а) ідентичний "тоне" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), що має при електрофорезі рухливість пре-β-ЛП. ЛП(а) містять 27% білка, 8% вуглеводів та 65% ліпідів, з яких ЕХС становлять 59%, НЕХС – 14%, ФО – 14%.

Білковим компонентом ЛП(а) є високоглікозильований поліпептид -апо(а), що має близьку структурну спорідненість до плазміногену - одному з факторів системи згортання-протизгортання крові. При зростанні концентрації ЛП(а) у крові порушуються процеси мікроциркуляції у кровоносних артеріях з можливим утворенням мікротромбів.

Завдяки наявності в структурі апо(а) сіалових кислот ЛП(а) більш негативно заряджений у порівнянні з β-ЛП в електричному полі, краще розчинний у воді, може взаємодіяти з іонами металів (кальцію). Цей ліпопротеїн гетерогенний. Усе це свідчить про особливу роль ЛП(а) у атерогенезі.

ЛП(а) можуть взаємодіяти з ЛПНГ-рецепторами, надаючи слабкий вплив на активність ГМК-КоА редуктази, на естеріфікацію ХС. Період напіврозпаду ЛП(а) довше, ніж у ЛПНГ, і становить 3,3 діб. Вміст ЛП(а) у крові в нормі не перевищує 30 мг/л. При високій концентрації в крові ЛП(а) виявляється в місцях ураження судин в області скупчення фібриногену. Підвищена концентрація ЛП(а) часто поєднується з II a II б типами гіперліпопротеїнемій. Тому в клінічній практиці вкрай важливим є визначення ЛП(а) одночасно з визначенням білків гострої фази запалення. Встановлено, що більшість гіполіпідемічних препаратів не впливають на підвищений рівень ЛП(а). Світові популяційні дослідження показали, що ЛП(а) є самостійним і незалежним фактором ризику ІХС - найбільш тяжкого прояву атеросклерозу.

Фракція ЛП(а) гетерогенна. Встановлено, що при електрофорезі ЛП(а) знаходяться в ділянці β-глобулінів, але до 5% ЛП(а) при цьому можуть виявлятися в ділянці α-глобулінів.

Усе свідчить про крайню важливість розробки способів лабораторної діагностики, що дозволяють найбільш повно виявляти ЛП(а), включаючи мінорні фракції ЛП(а).

Істотні ознаки,характеризують винахід, виявили в заявляється сукупності нові властивості, що явно не випливають з рівня техніки в даній галузі і не очевидні для фахівця.

Ідентичної сукупності ознак не виявлено щодо патентної і науково-медичної літератури.

Даний винахід може бути використаний у практичній охороні здоров'я для підвищення точності діагностики у хворих на ІХС.

Таким чином, слід вважати це технічне рішення відповідним умовам патентоспроможності: «Новизна», «Винахідницький рівень», «Промислова застосовність».

Винахід буде зрозуміло з наступного опису та доданих креслень.

На фіг.1 представлені результати електрофоретичного поділу на фракції ЛП сироватки крові: а - у групі контролю способом-прототипом, б - у групі контролю пропонованим способом;

На фіг.2 (а, б, в) представлені результати електрофоретичного поділу на фракції ЛП сироватки крові хворих на ІХС (І група);

На фіг.3 представлені результати електрофоретичного поділу на фракції ЛП сироватки крові хворого на ІХС (клінічний приклад): а - способом-прототипом, б - пропонованим способом.

Спосіб здійснюється наступним чином поетапно:

1) приготування розчину Судану Б: 400 мг Судану Б розчиняють у 20 мг етиленгліколю на киплячій водяній бані протягом 50 хвилин, фільтрують, зберігають у скляному посуді;

2) приготування гелю агарози: 320 мг агарози фірми "Sigma" розчиняють в 20 мл води для кип'ятіння, потім поміщають в термостат при 55°С; додають 20 мл розчину альбуміну (1 г альбуміну в 200 мл вероналмедіналового буфера, pH 8,6). 3 мл гелю агарози наносять на знежирене горизонтально встановлене предметне скло, поміщають металевий сталевийстрижень-брусок 4×20 мм (заввишки 10 мм), який після застигання гелю прибирають магнітом;

3) до 0,3 мл проби сироватки крові пацієнта додають 0,1 мл 0,1% розчину тритону Х-100, інкубують 15 хв при 20°С, додають 0,15 мл розчину Судану Б, поміщають на 1 годину в темний термостат при 40°С, потім додають 0,2 мл гарячого розчину гелю агарози, змішують, підігрівають при 55°З підігрітим вносять в лунку гелю агарози розміром 4×20×10 мм;

4) предметне скло поміщають у камеру для електрофорезу шаром агарози вниз, електрофорез проводять у холодильній камері при температурі 4°З напрузі 100 В і силі струму 40-45 мА;

5) електрофореграму фіксують у 5% розчині оцтової кислоти протягом однієї години, потім висушують між листами фільтрувального паперу, безперервно змочуючи 96% етиловим спиртом;

6) денситометрію проводять на мікрофотометр МФ-4.

У групі контролю у разі використання способу-прототипу n=10 (фіг.1a) і запропонованого способу n=14 (фіг.1б) виявлені ХМ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ і ЛПВЩ - це нормальна ліпідограма.

Нами обстежені 2 групи хворих на ІХС: I - група (n=20) способом прототипом і II - група (n=31) запропонованим способом.

У пацієнтів I групи виявлено II a (фіг.2а), II б (фіг.2б) та IV типи гіперліпопротеїнемій (фіг.2в), а також "слідова" фракція ЛП(а).

У пацієнтів II групи з наявністю гіперхолестеролемії (ГХС) у межах 7,7-13,2 ммоль/л (середнє значення 9,3±0,7 ммоль/л), крім фракцій ХМ, ЛПВЩ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ, виявлялася інтенсивна фракція ЛП(а), посилена присутністю мінорних підфракцій ЛП(а). Інші фракції, а саме ЛПНГ, ЛПДНЩ і ЛПЗЩ були теж більш інтенсивними. Слід пам'ятати, що у цій ситуації 5% фракції ЛПВЩ припадає на мінорні фракції ЛП(а).

Пацієнт К., 58 років: історіяхвороби № 87. Надійшов у відділення ІХС та атеросклерозу НДІ кардіології ТНЦ СО РАМН зі скаргами на колючі та стискуючі болі за грудиною та в області серця, що виникають при фізичному навантаженні, що знімаються нітрогліцерином, а також зі скаргами на біль у підребер'ї, . АТ 200/110 мм рт.ст., пульс у спокої 74 удари на хвилину.

Діагноз: ішемічна хвороба серця; стенокардія напруги ФК II-III; артеріальна гіпертензія.

Результати лабораторних досліджень: ХС загальний – 9,3 ммоль/л, тріацилгліцерол – 1,9 ммоль/л, ХС ЛПВЩ – 0,96 ммоль/л. Результати електрофоретичного дослідження крові цього пацієнта за способом-прототипом представлені на (фіг.3а), а за пропонованим способом представлені на (фіг.3б). Виявлено сліди ХМ, ЛПНЩ, ЛПДНЩ, ЛПВЩ, ЛП(а) з присутністю мінорних фракцій ЛП(а) у складі ЛПВЩ, а також інших мінорних фракцій ЛП, оскільки всі виявлені фракції стали значно інтенсивнішими.

При дослідженні ЛП сироватки крові хворого на ішемічну хворобу серця (ІХС) за способом-прототипом (клінічний приклад) виявлено ХМ, β-ЛП (ЛПНЩ), пре-β-ЛП (ЛПДНЩ), β-ЛП (ЛПЗЩ) та «слідова фракція» ЛП(а) (фіг.1в), а при дослідженні за пропонованим способом виявлені інтенсивні фракції ЛП в зоні між β-і пре-β-ЛП, також посилені фракції ЛПНЩ, ЛПДНЩ (фіг.1ж).

Використання запропонованого способу дозволило виявити у хворих на ІХС з вираженою гіперліпопротеїнемією наявність мінорних фракцій ЛП у гелі агарози.

Застосування пропонованого способу поділу на фракції ЛП крові на відміну способу-прототипу дозволяє виявити мінорні фракції ЛП(а), що підвищує чутливість і точність способу. При цьому пропонований спосіб простий у використанні та інтерпретації отриманих результатів.

Спосіб визначення фракційліпопротеїнів крові у хворих на ішемічну хворобу серця за допомогою електрофорезу в гелі агарози шляхом обробки проби сироватки крові пацієнта протягом 1 год розчином барвника Судану Б у темному термостаті при 40°С, прогріту суміш вносять в лунку гелю агарози об'ємом 4×20×10 мм подальшою фіксацією електрофореграм, їх висушуванням і денситометрією, який відрізняється тим, що додатково перед обробкою Суданом Б до 0,3 мл проби сироватки крові пацієнта додають 0,1 мл 0,1% розчину тритону Х-100 і інкубують 15 хв при 20° З.