Техніка фарбування мазків - стор
Забарвлення мазків
Техніка фарбування мазків.Для фарбування мазків користуються розчинами фарб або фарбуючим папером, що запропоновано А.І. Синьовим. Простота приготування, зручність застосування, а також можливість зберігання паперу, що фарбує, протягом необмежено тривалого часу стали підставою для широкого їх використання при різних способах забарвлення.
Забарвлення мазків барвником. На висушений і фіксований препарат наносять кілька крапель води, кладуть забарвлені папірці величиною 22 см. Протягом усього часу фарбування папір повинен залишатися вологим і щільно прилягати до поверхні скла. При підсиханні папір додатково змочують водою. Тривалість фарбування мазка визначається методом фарбування. Після закінчення фарбування папір обережно знімають пінцетом, а мазок промивають водопровідною водою і підсушують на повітрі або фільтрувальним папером.
Забарвлення мазків розчинами барвників. На висушений і фіксований препарат наносять піпеткою барвник у такій кількості, щоб він покривав весь мазок. При фарбуванні мазків концентрованими розчинами барвників (карболовий фуксин Циля, карболовий генціановий або кристалічний фіолетовий) фарбування проводять через фільтрувальний папір, що затримує частинки барвника: на фіксований мазок кладуть смужку фільтрувального паперу і наливають розчин барвника.
Для мікроскопічного дослідження приготовлені мазки, висушені та зафіксовані, піддають фарбуванню. Забарвлення буває просте і складне. Просте фарбування полягає у нанесенні на мазок будь-якої однієї фарби на певний проміжок часу. Найчастіше для простого фарбування застосовують спирто-водний (1:10) фуксин Пфейффера, леффлерівську метиленову синьку тасафранін. Еозин, як кисла фарба, використовується лише забарвлення цитоплазми клітин і підфарбовування фону. Кислий фуксин непридатний для фарбування бактерій.
При простому забарвленні мікробні тіла сприймають колір фарби так само інтенсивно, як і ядра клітин; в той же час цитоплазма і весь фон мазка (якщо це не мазок із чистої культури) забарвлюються в той же колір, але дещо блідіший. Фуксин і генціанвіолет відносяться до інтенсивніше фарбуючих фарб; метиленова синька забарвлює значно блідіше. Сприйняття забарвлення залежить як від властивостей фарб, а й від властивостей піддаються фарбуванню мікробів. Більшість мікробів легко і швидко фарбується водними чи спиртоводними розчинами фарб.
Для мікробів, що важко сприймають забарвлення (наприклад, збудник туберкульозу) або їх частин (спори, джгутики тощо) доводиться застосовувати більш інтенсивні (форсовані) методи забарвлення.
Форсувати забарвлення можна: а) підвищенням барвника основних фарб, б) подовженням терміну забарвлення і в) дією протрав.
Для підвищення фарбуючої здатності впливають на фарбу високою температурою (нагріванням) до появи пари (аж до кипіння). Варіюючи ступінь нагрівання, можна отримувати різні ступені сили фарбування.
Подовження терміну впливу барвника на об'єкт також може певною мірою посилити ступінь забарвлення.
Протравами є речовини, що полегшують проникнення фарби всередину клітин: фенол, танін, оцтова і хромова кислоти, луги та ін. Механізм дії протру різний: в одних випадках протрави діють на фарби, в інших-на здатність клітин до сприйняття забарвлення. Протравами впливають на мазок або перед дією фарби (наприклад, при фарбуванні джгутиків), або спільно зфарбою (фенол у фуксині Ціля), або після дії фарби (люголівський розчин у методі Грама).
При фарбуванні мазків, крім фарб, застосовуються ще так звані речовини, що знебарвлюють або розфарбовують. Останні служать для видалення надлишку фарби з усієї мікробної клітини або з її частини при надто енергійної адсорбції фарби матеріалом або при перефарбуванні його із застосуванням нагрівання і т.п.
Як знебарвлювальні речовини застосовуються: спирт, 5% водний розчин сірчаної кислоти, 20-30% водний розчин азотної кислоти, 3% розчин соляної кислоти в абсолютному алкоголі та ін.
Для фарбування мазків необхідно мати на робочому столі набір фарбуючих розчинів у флаконах (краще помаранчевого скла) з піпетками та гумовими балончиками. Флакони мають бути забезпечені етикетками з відповідними позначеннями; щоб уникнути швидкого забруднення фарбами етикетки рекомендується просочувати розплавленим парафіном (за допомогою пензлика). Флакони з фарбами поміщають у дерев'яний штатив – колодку (рис. 2).
Мал. 2. Флакони для фарб
Для змивання фарб і ополіскування мазків необхідні сулія з тубусом на підставці для дистильованої води та кристалізатор (зливна чашка) з підставкою-містком для мазків. Підставка-місток є дві скляні трубки або палички, з'єднані на кінцях відрізками гумових трубок. Ширина підставки повинна бути меншою за довжину предметного скла. Крім того, для фарбування мазків необхідні спиртовий (або газовий) пальник і пінцет Корне для предметного скла. При фарбуванні з підігрівом предметне скло захоплюють пінцетом і витримують певний час над полум'ям. При тривалому забарвленні вживають кюветки або невеликі стаканчики, куди наливають фарбу і занурюють уїї мазок. При одночасному забарвленні в кюветці кількох мазків, для того, щоб скла не злипалися, їх з'єднують по два намазаними сторонами назовні і зміцнюють гумовими кільцями, нарізаними з трубок. Після фарбування мазки промивають водою і ретельно висушують фільтрувальним папером.
Роботами останніх років виявлено можливість збереження при фарбуванні життєздатності мікробів, головним чином спороносних. Тому потрібна достатня фіксація мазків. Промивні води (при фарбуваннях) потрібно зливати в спеціальну посудину з подальшим знешкодженням, відпрацьований фільтрувальний папір (після просушки мазків) не викидати, а спалювати, використані мазки дезінфікувати.
Прості методи фарбування мазків
При простому методі фарбування на фіксований мазок наливають кілька крапель спирто-водного або водного розчину фарби на 1-2 хвилини; найчастіше з цією метою застосовується фуксин (1:10) чи леффлеровская метиленова синька. Потім фарбу змивають дистильованою водою і обмазують мазок між двома смужками фільтрувального паперу. Зазвичайфуксином(1:10) фарбують 10-30 секунд, аметиленовою синькою- 2-10 хвилин. Фуксин забарвлює мазки інтенсивніше, а при фарбуванні метиленової синькою виходять ніжні, більш витончені препарати. Мазок після обсушування фільтрувальним папером повинен бути абсолютно сухим, в іншому випадку при зіткненні вологи, що залишилася, з кедровим маслом утворюється емульсія і при мікроскопії вийде неясне зображення. Взагалі, тривалість фарбування залежить від виду і якості розчину, що фарбує, ступеня сприйнятливості мікроба до фарбування і товщини мазка.
Забарвлення за Муромцевим
Готують два розчини:
Карболова кислота (кристалічна)
Після розчиненняфарби обидва розчини змішують і профільтрують через паперовий фільтр. Фарба зберігається тривалий час. Мазки фарбують через смужки фільтрувального паперу протягом 15 – 30 секунд.
При цьому забарвленні мазків у мікробних клітинах виявляються включення, біполярність, капсули та суперечки. Метод зручний для фарбування мазків з органів, крові, культур на середовищах з нативним білком та на напіврідкому агарі.
Фон препарату із зазначених субстратів рожевий; клітини тканини та мікробні тіла забарвлюються у блакитно-сині кольори.
Складні (диференціальні) методи фарбування мазків
Складні методи фарбування ґрунтуються на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини. Сутність цих методів полягає у впливі на мазок двох фарбуючих речовин, з яких одна є головною (основною) фарбою, а інша – додатковою (контрастною). Після дії першої фарбою мазок знебарвлюють і тільки після цього піддають додатковому фарбуванню. Як знебарвлювальні речовини може бути застосований цілий ряд хімічних реагентів (кислоти, луги, спирт, ацетон та ін). Промивання мазка простою водою також є чисто механічним процесом знебарвлення, але для цього потрібен тривалий час; крім того, знебарвлення виходить неповним. По відношенню до знебарвлюючих речовин можна розбити мікробів на групи легко і важко знебарвлюються. Не всі види бактерій однаково ставляться до знебарвлюючих реагентів; деякі є кислото-і спиртостійкими, інші лише кислотостійкими. Нарешті, деякі, наприклад, суперечки, енергійно протистоять дії всіх знебарвлювальних речовин і відносяться до групи стійких до фарб.
Складні методи фарбування мають важливе диференційно-діагностичне значення для характеристики досліджуваногомікроба.
Забарвлення за Грамом
При обробці мазків (зрізів) з органів і тканин, що містять мікроорганізми, генціанвіолетом, а потім йодом, препарат, пофарбований у чорний колір, має властивість знебарвлюватися під дією спирту. При цьому одні з бактерій, що містяться в мазку, також знебарвлюються, а інші забарвлюються в фіолетовий колір. При додатковому забарвленні (зокрема, фуксином Пфейффера) знебарвлені спиртом бактерії забарвлюються в червоний колір (грамнегативні). Інші ж, що міцно утримують фіолетове забарвлення (з'єднання йод + генціанвіолет), які не знебарвлюються спиртом, відносяться до групи грампозитивних бактерій. Різниця між грампозитивними та грамнегативними бактеріями залежить від відмінності їх ізоелектричних точок, а здатність грампозитивних бактерій утримувати забарвлення пов'язана з присутністю в них магнієвої солі рибонуклеїнової кислоти, якої грамнегативні бактерії не містять. Найкраще забарвлення за Грамом виходить після фіксації мазків фізичним методом (нагріванням). Особливості відношення тих чи інших видів бактерій до різних фарб, зокрема до забарвлення за методом Грама, характеризують так звані тинкторіальні властивості мікробів.
Техніка забарвлення.На фіксований жаром мазок кладуть смужку фільтрувального паперу величиною трохи коротше і вже предметного скла, наливають на неї достатню кількість розчину кристалвіолету, карболового або анілінового розчину генціанвіолету, або іншої будь-якої фіолетової трифенілметан метилвіолету) на 1-2 хвилини. Потім фарбу зливають, видаляють смужку фільтрувального паперу і, не змиваючи водою, наливають на мазок розчин Люголю на 1-2 хвилини. Розчин зливають та знебарвлюють препарат у 96° спирті протягом 30-60 секунд, промиваютьводою і додатково фарбують фуксином Пфейффера (або розведеним сафраніном, нейтральротом або везувіном) протягом 2-3 хвилин. Потім фарбу змивають водою, а мазок висушують чистим фільтрувальним папером.
Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні мазків за Грамом грампозитивні мікроби будуть пофарбовані в темно-фіолетовий колір, а грамнегативні - у колір додаткової фарби (наприклад, у рожевий колір фуксину Пфейффера).
Не можна користуватися забрудненим фільтрувальним папером: можливе механічне перенесення мікробів з одного мазка на інший, що може позначитися на результатах мікроскопії. Тривалість дії фарбою, розчином Люголя (протравою) та спиртом залежить від товщини мазка. Особливо відповідальним моментом у забарвленні за Грамом є знебарвлення мазка спиртом. При короткому впливі спирту виходять перефарбовані препарати, а при тривалому всі мікроби (у тому числі і rpaмпозитивні) знебарвлюються. На густий, товстий мазок (наприклад, з агарової культури) час впливу спиртом має бути більшим, ніж тонкий мазок, особливо з рідких культур. При дії спиртом на нерівномірно приготовлений мазок у товстих його частинах мікроби залишився не знебарвленими, а в тонких знебарвлюються; вийде «строката» картина забарвлення, що може призвести до неправильних висновків.
Іноді в культурі грампозитивних бактерій можуть спостерігатися грамнегативні особини, яких більше, ніж старше населення. Це ніщо інше, як бактеріальні трупи, які зазнали внутрішньоклітинного автолізу, в результаті якого клітина втратила рибонуклеїнатів магнію. З іншого боку, в дуже молодих культурах (кілька годин росту) із сімейства ентеробактерій гігантські, юні форми цих бактерій, які в 2—3 рази більші за дорослі особини(18-годинних), дуже базофільні внаслідок перевантаження їхньої цитоплазми рибонуклеїнатами. Тому при фарбуванні за Грамом вони забарвлюються фуксином так інтенсивно, що при поганому освітленні їх можна прийняти за грампозитивні вегетативні форми спороносних паличок.
Для початківців, а також у сумнівних випадках, рекомендується на тому самому склі, де знаходиться досліджуваний мазок, приготувати на всі боки контрольні препарати — один із культури мікробів, свідомо грампозитивних, а інший — із грамнегативних.
При знебарвленні препарату в забарвленні за Грамом спирт можна наливати безпосередньо на мазок, постійно похитуючи скло. Краще ж знебарвлення проводити в кюветках, куди наливають спирт і, захопивши пінцетом Корне препарат, піднімають і опускають його, стежачи за кольором спирту, що стікає зі скла. Знебарвлення вважається закінченим, коли краплі спирту, що стікають з мазка, зрівняються за кольором зі спиртом в кюветці; зазвичай цього потрібно 10—30 секунд, залежно від товщини мазка.
Спирт 96 ° у кюветках слід частіше змінювати (80 ° спирт вже неправильно диференціює мазок). Відпрацьований спирт зазвичай зливають із кюветок у спиртові пальники.
Для початківців можна рекомендувати знебарвлення мазків йодованим спиртом. Встановлено, що якщо до рідини, що знебарвлює, додати трохи йодної настойки, то мікроби, що фарбуються грампозитивно, не знебарвлюються в такій рідині навіть протягом години, а грамнегативні розфарбовуються приблизно в 5 секунд. За даними Саватєєва, достатньо додати 2-4 мл 10% йодної настойки на 100 мл 95 ° спирту; розчин може зберігатися тривалий час. У разі, якщо замість спирту використовують ацетон, йодну настойку додають перед використанням.
Для знебарвлення мазків йодованим спиртомдостатньо двох хвилин, після чого слід промивка водою і додаткове фарбування фуксином Пфейффера.
Видозміни методу фарбування за Грамом
Забарвлення за Грамом у модифікації Хукера.
РозчинАдля приготування барвного реактиву: