Трансфекція тимчасова - Довідник хіміка 21
Хімія та хімічна технологія
Трансфекція тимчасова
Процедуру тимчасової трансфекції наведено у табл. 9.1. Детальний опис кальцій-фосфатного методу трансфекції можна знайти в гл. 15 тома II цієї серії [34]. Титр вірусу, отриманого таким шляхом, залежить від усіх параметрів, які в нормі впливають на ефективність трансфекції (чистота використовуваної ДНК, власна сприйнятливість клітин до цієї ДНК тощо), а також від властивостей конкретної векторної системи. Деякі ретровірусні конструкції відтворюються[c.288]
З появою генетичної інженерії методологія запровадження молекул ДНК у клітини ссавців привернула увагу багатьох дослідників. До цього часу вже було розроблено ряд методів трансфекції культивованих клітин тварин нуклеїновими кислотами різних вірусів.[c.332]
Як ми вже зазначали, під час роботи з тваринними клітинами використовують два типи векторів. У деяких випадках вони аналогічні бактеріальним плазмідам або фаговим векторам. Після трансфекції або інфікування ці вектори реплікуються та зберігаються у вигляді незалежних позахромосомних геномів або упаковуються в вірусні інфекційні частинки. В інших випадках вектори не здатні реплікуватися і використовуються для введення специфічних сегментів ДНК у клітини з метою вивчення тимчасової експресії клонованого гена або отримання стабільної трансформації при вбудовуванні вектора геном господаря.[c.260]
Оскільки всі описані на сьогоднішній день MLV-клітини, що пакують, ведуть свій початок або від ліній NIH3T3 або від лінії BALB/ЗТЗ, рекомбінантну ретровірусну ДНК в них можна легко ввести шляхом трансфекції, використовуючи стандартний метод кальцій-фосфатної преципітації 34]. Нетривала, такзвана тимчасова (transient), трансфекція може виявитися достатньою, щоб отримати вірусний препарат з низьким титром (зазвичай 10-Ю/мл). Однак, для досягнення більш високих концентрацій вірусу необхідні стабільно трансформовані клітинні лінії, що експресують домінантний селективний маркер. Такі лінії дозволяють одержувати препарати вірусу з титром Ю-10 інфекційних од./мл. Титр вірусних препаратів, отриманих шляхом тимчасової трансфекції, можна підвищити, якщо використовувати гібридний ретровірусний вектор, що містить повну ділянку ранніх генів вірусу поліоми, така конструкція зазнає в упаковувальних клітинах мультикопійну позахромосомну реплікацію [35].[c.288]
У літературі описано безліч методів виділення хромосом із клітин, блокованих у метафазі. Процедури очищення також різноманітні. Одні з них дозволяють отримати високоочищені препарати, інші - грубу фракцію хромосом, забруднену різними компонентами клітини. Ми вважаємо за краще використовувати для проведення трансфекції саме такі грубі препарати, по-перше, тому що їх отримання займає мало часу, а по-друге, тому що хромосоми при цьому найменш зруйновані.[c.25]
Слідкувати за кількістю та якістю доставленого всередину клітин вектора обов'язково тільки при розробці методики перенесення гена за допомогою ДНК (DMGT). Найбільш важливо оцінити виживання протопластів після трансфекції і, зрозуміло, спостерігати за експресією інтерналізованої ДНК. Загальна стратегія полягає у визначенні умов, які забезпечують ефективне поглинання недеградованої ДНК та високу виживання протопластів, а потім в аналізі тимчасової експресії векторної ДНК у популяції протопластів через кілька днів після обробки ПЕГ. Яктільки експресію маркерних генів буде оптимізовано, з'явиться потенційна можливість селекції окремих трансформованих колоній.[c.212]