Транспорт білків - Біологія
2.1 Транспорт білків
Необхідно також розглянути механізми, за допомогою яких білки доставляються до потрібного місця. Є кілька способів основним є екзоцитозний шлях.
Екзоцитозним в еукаріотичних клітинах називається шлях, за допомогою якого здійснюється транспорт білків, що секретуються клітиною або включаються до зовнішньої мембрани. Секретовані білки синтезуються на зв'язаних з мембранами рибосомах на цитоплазматичній поверхні шорсткого ендоплазматичного ретикулуму і виводяться з клітини за допомогою того ж механізму, який використовується для включення мембранних білків в ендоплазматичний ретикулум.
Якщо водорозчинний білок немає вторинних сигналів сортування, він транспортується до клітинної поверхні і секретується з допомогою «конститутивного» шляху. Білки, що транспортуються цим шляхом, переміщаються з ендоплазматичного ретикулуму послідовно через різні компартменти Гольджі комплексу і врешті-решт потрапляють на поверхню клітини. Вони можуть ставати компонентами цитоплазматичної мембрани або, за наявності вторинних сигналів сортування, залишатися в ендоплазматичному ретикулумі (рибофорин, цитохром Р450) або в комплексі Гольджі (різні глікозилтрансферази).
У комплексі Гольджі в ході подальшого сортування відокремлюються білки, секретовані конститутивним шляхом (укорочений шлях), від тих, що прямують у лізосоми або концентруються в секреторних гранулах, за допомогою яких вони потім секретуються при відповідній стимуляції клітини (тобто регульований секреторний шлях) . Крім того, виявлено, що у зовнішній мембрані ядерної оболонки також можуть синтезуватися мембранні глікопротеїни, які потім транспортуються за допомогою екзоцитозу.транспортування екзоцитозним шляхом піддаються посттрансляційним модифікаціям, зокрема глікозилюванню. Добре вивчено компартментацію процесингу N-пов'язаного олігосахариду, що дуже допомогло визначенню різних компонентів комплексу Гольджі.
Дослідження виявили кілька чудових особливостей системи екзоцитозного транспорту.
1. Транспорт між різними компартментами органели здійснюється за допомогою везикул, які відбруньковуються від «донорної» мембрани і потім зливаються з «акцепторною». Показано, що везикули, які беруть участь у транспорті між компартментами комплексу Гольджі, є «окаймленими», але відповідний білок відрізняється від клатрину, що оточує ендоцитозні везикули. Є вагомі дані на користь того, що клатрин не є суттєвим компонентом екзоцитозного шляху, хоча він, мабуть, необхідний для нормального зростання деяких штамів дріжджів.
2. Для внутрішньоклітинного транспорту необхідний АТР, і навіть білкові компоненти цитозоля. Показано, що для транспорту між цистернами Гольджі, що здійснюється за участю везикул, необхідне похідне жирнокислотне ацил-СоА . Яку саме функцію виконують зазначені сполуки у відпочковуванні та злитті везикул, невідомо.
3. Роль олігосахариду як сигналу сортування новосинтезованих глікопротеїнів, мабуть, є непостійною.
2.2 Сигнальні послідовності білків
У більшості білків, вбудованих в мембрану ендоплазматичного ретикулуму або перетинають її, на N-кінці є короткокороткий сигнальний пептид (від 15 до 30 амінокислотних залишків). Ця сигнальна послідовність безпосередньо взаємодіє принаймні з двома рецепторами, один з яких розчинний (сигналрозпізнаюча частка), а інший знаходиться вмембрані. Можна було б очікувати, що амінокислотна послідовність цього сигнального пептиду буде дуже консервативною і приблизно однаковою у всіх білків, що переносяться, але очікування ці не виправдалися. Ці сигнальні ділянки не відрізняються сталістю ні щодо довжини, ні щодо амінокислотної послідовності, а численні досліди з мутагенезу показали, що вони можуть зазнавати значних структурних змін. Дані про те, що сигнальні пептиди містять всю інформацію, необхідну для транспортування білків через мембрани ендоплазматичного ретикулуму або всередину, були отримані в дослідах з химерними поліпептидами. Приєднання N-кінцевої сигнальної послідовності до звичайних цитоплазматичних білків, наприклад, до глобіну, призводило до того, що вони транспортувалися в порожнину ендоплазматичного ретикулуму.
З точки зору «порівняльної анатомії» N-кінцевих сигнальних послідовностей можна виділити три різні в структурному відношенні ділянки: 1) позитивно заряджена N-кінцева ділянка (п-ділянка); 2) центральне гідрофобне ядро з 7-15 залишків (h-ділянка); З) С-кінцева ділянка (з-ділянка), яка є полярною і містить сайт, відомий сигнальною пепти-дазою, яка знаходиться на стороні ендоплазматичного ретикулума, зверненої в порожнину. Показано, що численні випадкові послідовності здатні виконувати функцію нормального сигнального пептиду інвертази дріжджів і детермінувати її секрецію. Аналіз цих випадкових послідовностей показав, що вирішальним чинником є їхня гідрофобність. Наведено дані про гідрофобність та довжину гідрофобних ділянок відомих сигнальних пептидів еукаріотів та більшості гідрофобних ділянок, виявлених у цитозольних білках еукаріотів (багато з яких розташовані на N-кінці),а також відомих трансмембранних якірних ділянок мембранних білків. З цих даних видно, що h-область має властивості, проміжні між властивостями відповідних ділянок цитозольних білків, з одного боку, і типових трансмембранних сегментів - з іншого.
Очевидно, структурна специфічність для процесу впізнавання не відіграє суттєвої ролі. Однак необхідно пам'ятати, що зміна вільної енергії менш ніж на 5 ккал/моль (приблизно така енергія одного водневого зв'язку) відповідає зміні спорідненості в 1000 разів. Така відмінність у спорідненості цілком може бути зумовлена тонкими відмінностями між функціональними та нефункціональними сигнальними послідовностями. Моделью рецептора сигнального пептиду може бути розчинний фрагмент антигену гістосумісності класу I, а саме HLA-A2, тривимірна структура якого відома. Цей білок пов'язується з пептидами – компонентами чужорідних антигенів, що є частиною імунної відповіді. Область зв'язування пептиду являє собою великий жолобок, відкритий з одного кінця і здатний вміщати пептид з 20 залишків амінокислот, якщо той має форму а-спіралі. Про пептиди, які можуть зв'язуватися з HLA-A2, відомо небагато; показано, зокрема, що близькоспоріднений антиген гістосумісності класу II виявляє високу спорідненість до різних амінокислотних послідовностей. Очевидно, найбільш важливими більшими характеристиками пептидів, які можуть пов'язуватися з високою спорідненістю, є вторинна структура та амфіфільність. Стабілізації комплексу можуть сприяти численні взаємодії у сфері зв'язування.
Відомо, що щодо невеликі різницю між сигнальними послідовностями породжують величезні різницю у поведінці білка. Наприклад, якщо сигнальнапослідовність не розпізнається сигнальною пептидазою, то білок частіше залишається пов'язаним з мембраною, ніж секретується, хоча є винятки з цього правила. Зазвичай сигнальні послідовності, які служать також N-кінцевими якорями, мають протяжніший гідрофобний h-ділянка довжиною близько 20 амінокислотних залишків; ця ділянка необхідна для зупинки перенесення та/або утворення стабільного якоря в мембранному бішарі. Прикладом такої сигнальної/якорної послідовності є трансферриновий рецептор. Зауважимо, що в цьому випадку сигнальна послідовність розташована не на N-кінці, а на відстані більш ніж 50 амінокислотних залишків від нього.
Відомі також випадки, коли сигнальна послідовність закріплює зрілий білок у протилежній орієнтації, тобто N-кінець виявляється зверненим назовні. Як приклад можна навести цитохром Р450 мікросом щура.
Якимось чином ці сигнальні/якірі послідовності «проштовхують» свій N-коєєць через мембрану і зупиняють трансляцію, так що основна частина білка залишається в цитоплазмі. Зазначалося, що у деяких із цих випадків сигнальні послідовності «старт/стоп» несуть принаймні одні негативний заряд п-області. Однак для вбудовування вказаних мембранних білків, як і білків звичайного типу, використовується однаковий апарат перенесення СРЧ. Можливо, наявність негативного заряду полегшує мимовільне або опосередковане білком перенесення N-кінцевих залишків через мембрану.
Як ми вже зазначали, сигнальні послідовності не обов'язково знаходяться на N-кінці білкової молекули і можуть спрямовувати перенесення обох фланкуючих домеїй, принаймні у разі штучних гібридних білків. Унікальним прикладом такого роду є овальбумін, секреція якогодетермінується внутрішньою сигнальною послідовністю, що не відщеплюється. У багатьох мембранних білків ендоплазматичного ретикулуму невідщеплювані сигнальні послідовності теж розташовані в середній частині поліпептидії ланцюга і відіграють роль трансмембранії якорів. Як приклад можна навести асіалоглікопротеїновий рецептор. Внутрішня послідовність сигнального цього білка використовує той же апарат переносу, що і N-кінцева послідовність; і справді, у штучних гібридах ця внутрішня сигнальна послідовність функціонує як звичайна N-кінцева послідовність. Прикладами білків з внутрішньою невідщеплюваною сигнальною послідовністю, які мають численні трансмембранние сегменти і N-кінець яких знаходиться на внутрішній стороні мембрани, служать переносник глюкози і аніонний переносник білок смуги 3. Навпаки, у опсина, що теж містить внутрішній невідщеплюваний сигнальний пептид, із зовнішнього боку мембрани. Цей внутрішній сигнал (приблизно перший трансмембранний сегмент) простягає гідрофільний амінокислотний домен (36 амінокислотних залишків) через мембрану, і, таким чином, його орієнтація протилежна тій, яка спостерігається в більш загальному випадку при перенесенні поліпептиду, починаючи з С-кінця. Причина такої поведінки опсину невідома; Можливо, значної ролі грає природа N-кінцевого пептиду.
Отже, від невеликих змін у сигнальних послідовностях залежить, чи буде «білок-пасажир» секретуватися в порожнину ендоплазматичного ретикулуму або він залишиться прикріпленим до мембрани, і якою буде орієнтація N-кінця мембранного білка. Було показано, що є всі можливі топологічні варіанти. Важливим моментом є те, що у всіх випадках збирання здійснюється за допомогоюодного й того самого апарату.
2.3 Стоп-сигнали перенесення
Як зазначалося в попередньому розділі, для невідщеплюваних сигнальних послідовностей, які відіграють роль N-кінцевих якорів в мембранному білку, що утворився, характерна наявність відносно довгих гідрофобних ділянок. Звідси випливає, що перенесення може зупинятися просто за наявності протяжної гідрофобної ділянки, здатної утворити трансмембранну а-спіраль. На користь такого припущення свідчать деякі експериментальні дані. Наприклад, за допомогою рекомбінантної ДНК у середню частину білка £. coli, що в нормі секретується через плазматичну мембрану, вбудовували гідрофобні сегменти. Якщо їхня довжина була не менше 16 амінокислотних залишків, то транспорт білка блокувався і він залишався приєднаним до плазматичної мембрани. Можна заперечити, що в даному випадку йдеться про бактеріальну систему, але, як ми побачимо нижче (див. розділ, присвячений сигнальним послідовностям бактерій), механізми перенесення в про- та еукаріотних системах, мабуть, подібні. Далі були сконструйовані варіанти G-білка везикулярного вірусу стоматиту зі зміненими мембранними доменами. Довжина гідрофобного сегмента могла становити не 20 а 8 залишків, при цьому поліпептид залишався трансмембранним, хоча транспорт в мембрану плазматичну блокувався. Таким чином, природа стоп-сигналу перенесення точно не відома. Необхідно з'ясувати два питання: 1) чи беруть участь у зупинці процесу специфічні білки апарату перенесення; 2) чи визначається зупинка перенесення гідрофобією стоп-сигналу або якимись більш тонкими факторами? Було показано, що ділянки стоп-сигнальї послідовності, відповідальні за блокування перенесення через ендоплазматичний ретикулум, можуть ніяк не впливати натранспорт через мембрану хлоропласту. Це означає, що згадані два процеси можуть суттєво відрізнятися.
Визначення старт-і стоп-сигналів має на увазі лінійну схему переносу, що починається з N-кінця; Про це свідчить поведінка простих систем. Однак виявилося, що послідовності, що блокують перенесення в одному випадку, можуть ініціювати його в іншому.
Отже важлива як послідовність а й її оточення в полипептиде.