Виділення білків
Виділення практично чистого індивідуального білка (у разі нерідко вживають недостатньо вдалий термін " гомогенний білок " ) — необхідна передумова вивчення його будови і функціональних властивостей. Технічні прийоми, що використовуються для цього, дуже різноманітні і швидко вдосконалюються, причому поряд з розвитком мікрометодів все частіше виникає необхідність масштабування процесів з тим, щоб отримувати великі кількості високоочищених білків для потреб медицини та біотехнології. Особливо загострилася потреба у ефективних методах поділу білків з розвитком генно-інженерних способів їх одержання. У цьому розділі розглянуті лише найзагальніші принципи препаративної хімії білків.
Особливості виділення білків
Отримання чистих хімічних індивідуальних білків включає як видалення небілкових домішок, так і поділ між собою власне білкових компонентів. Остання частина завдання з подібності фізико-хімічних властивостей білків особливо складна, тому саме її вирішення визначає вибір тих чи інших схем виділення білка. У цьому необхідно враховувати деякі особливості поведінки, властиві всім білкам.
До них належить, насамперед, здатність білків піддаватися денатурації,тобто. зазнавати таких змін просторової будови, які призводять до втрати або часткової втрати функціональних властивостей. Щоправда, денатурація у багатьох випадках оборотна, проте ця оборотність не забезпечується автоматично, а вимагає у кожному окремому випадку добору спеціальних прийомів. У той же час, повністю або навіть частково денатуровані білки дуже вразливі для незворотних пошкоджень, особливо для дії протеолітичних ферментів, тому умов,сприяють денатурації, слід всіляко уникати.
Для запобігання тепловій денатурації виділення білка проводять за низької температури, зазвичай при 4 ºС. Необхідно також уникати крайніх значень pH. Білки легко денатурують при низьких рН через протонування негативно заряджених у нормальних умовах карбоксильних груп і виникає внаслідок цього різкого переважання позитивних зарядів, що сприяє розгортанню компактної структури. У лужному середовищі при рH 10 і вище втрачаються позитивні заряди, зумовлені протонуванням ε-аміногруп лізину, і знову настає декомпенсація зарядів на поверхні, що дестабілізує глобулу. Одночасно фенольні гідроксили тих залишків тирозину, які були приховані всередині глобули, отримавши негативний заряд, прагнуть вийти на поверхню, що також сприяє денатурації білка.
У ще більш лужних розчинах відбуваються реакції, що незворотно ушкоджують білок,— відщеплення сірки від залишків цистеїну та цистину, β-елімінування фосфатних залишків у фосфопротеїнах, відщеплення полісахаридних ланцюгів, приєднаних до залишків серину. Залишки ненасиченої амінокислоти, що утворюються в результаті цих реакцій, — дегідроаланіну — приєднуються до наближених ε-аміногруп лізину з утворенням так званого лізиноаланіну — сполуки, присутність якої в кислотному гідролізаті білка свідчить про глибоке пошкодження його структури.
Причиною денатурації може стати застосування органічних розчинників, здатних порушити суттєву для стабільності білка систему гідрофобних контактів усередині глобули. Потрібно також враховувати можливість денатурації білка на межі розділу фаз, особливо при утворенні піни. При виділенні дуже малихкількостей білка, не рідко в сучасній біохімії, слід зважати на втрати, викликані його адсорбцією,часто незворотною, на поверхні скла або полімерних матеріалів, особливо значної на заключних стадіях очищення.
Особливу небезпеку при виділенні білків представляють протеолітичні ферменти, що містяться у вихідному матеріалі, навіть якщо вони присутні в слідових кількостях. Ушкодження, що призводить до утворення хибних множинних форм білка, а іноді і його глибоке розщеплення стають особливо ймовірними, якщо схема виділення включає умови, що наближають до денатурації білок. Для запобігання протеолізу необхідно вже на ранніх стадіях очищення включати операції, спрямовані на відділення протеїназ, додавати до суміші інгібітори різних класів протеїназ. Дуже важливо проводити очищення білка швидко, що знижує небезпеку протеолізу та ймовірність денатурації.
Поширена думка про особливу нестабільність чистих білків. Дійсно, сторонні білки, що містяться в неочищених препаратах, певною мірою захищають білок від денатуруючих впливів і протеолізу. На проміжних стадіях, коли повна
очищення ще не досягнуто, небезпека протеолізу збільшується, з видаленням же слідів протеїназ на завершальних етапах очищення стабільність білка повинна знову зрости. Втім, зростає і небезпека втрат сорбцій на поверхнях, які можуть сприйматися експериментатором як властива чистому білку нестабільність.
Характерні властивості білків, на яких ґрунтується їх поділ
На яких фізико-хімічних особливостях білків можуть бути засновані способи їхнього поділу? По-перше, це розмір молекули, її геометрія. На використанні цієї особливості базуються методи гель-хроматографії.та ультрафільтрації, частково електрофорез у гелях.
По-друге, характерний для даного білка розподіл заряджених груп на його поверхні. компенсовані і сумарний заряд дорівнює нулю) значно різняться в різних білків. Відомі білки, що є у фізіологічних умовах катіонними, аніонними чи молекулами без помітного переважання того чи іншого заряду. На відмінності заряду білків за різних рН засновано їх поділ методами електрофорезу, ізоелектричного фокусування, ізоелектричної та іонообмінної хроматографії. Істотно, проте, як співвідношення заряджених груп, визначальне значення pI. Білки зі подібними изоэлектрическими точками можуть відрізнятися розподілом заряджених функціональних груп на поверхні глобули. Останні розміщуються більш менш рівномірно або; навпаки, утворюють локальні згущення, грона однаково заряджених груп, що дається взнаки при іоннообмінній хроматографії білка.
По-третє, білки розрізняються числом та характером гідрофобних ділянок поверхні, що використовують при гідрофобній хроматографії
Зауважимо, що жодна з розглянутих вище ознак не може сама по собі забезпечити виділення індивідуального білка зі складної суміші – вони недостатньо характерні, не гарантують вибірковість очищення. Значно перспективніше щодо цього
використання для виділення функціональних властивостей білка.Дійсно, серед безлічі білків у вихідному матеріалі знайдеться чимало таких, які мають подібну молекулярну масу або близькі ізоелектричні точки, проте число, наприклад,фосфатаз або амілаз буде свідомо невеликим. Очевидно, що метод виділення, заснований на використанні здатності цих ферментів взаємодіяти зі своїм специфічним субстратом, є незрівнянно вибірковим, ніж будь-який прийом, що базується на різниці фізико-хімічних властивостей.
Схеми виділення білків, що використовують лише один будь-який принцип, рідкісні, зазвичай різні підходи до фракціонування поєднуються і доповнюють один одного.
Поділ білків за молекулярною масою. Гель-хроматографія (гель-фільтрація)
У цьому методі використовують гранульовані геліпоперечно-зшитих гідрофільних матеріалів, наприклад, декстрану (сефадекс, сефарозу та їх аналоги), поліакриламіду (біогелі та їх аналоги), полівінілового спирту (тойоперл). Гранули утворені тривимірною сіткою полімеру, яка непроникна для великих молекул, частково проникна для молекул проміжного розміру і добре проникна для невеликих молекул, солей та води. Залежно від середнього розміру осередку полімерного гелю та геометрії молекули останньої доступна більша або менша частина загального обсягу гранул гелю.
При русі розчину, що містить білки та інші молекули, по колонці, яка заповнена набряклими гранулами гелю, компоненти суміші, що проникли в гель, затримуються в ньому. Таким чином, вони відстають від більших молекул, які не можуть увійти всередину гранул і знаходяться тільки в розчині, що омиває їх. Не будучи включеними в гель великі молекули з'являються в елюаті, як тільки через колонку пройде "вільний" об'єм розчину
Якщо розміри молекул білка такі, що вони можуть проникати в пори, що становлять деяку частину об'єму гранул, то спостерігатиметься затримка елюції і білок з'явиться в обсязі Ve, пов'язаному з коефіцієнтом доступності (часткою об'єму гранул,доступною даному виду молекул) співвідношенням:
де V - повний обсяг колонки, за вирахуванням тієї його частини, яка припадає на сам гель утворює полімер.
Кожному білку в залежності від розмірів його молекули відповідає своє значення, на чому і заснував поділ при хроматографії. Зрозуміло, що якщо обсяг елюції