Визначення лужної фосфатази
Визначення активності лужної фосфатази у сироватці крові кінетичним методом
Принцип методу:Лужна фосфатаза (ЩФ) у сироватці визначається шляхом вимірювання швидкості гідролізу ефіру фосфорної кислоти -п-нітрофенілфосфату.
Швидкість гідролізу субстрату прямо пропорційна активності ЛФ у пробі та вимірюється спектрофотометрично при довжині хвилі 405 нм.
Лінійність методу: до 800 Е/л.
Норма: 35-123 Е/л (37С).
ЛФ у негемолізованій сироватці зберігає стабільність при температурі зберігання 2-8С протягом 2 днів.
Обладнання та реагенти:
Спектрофотометр із термостатованою кюветою, довжина хвилі 405 нм, довжина оптичного шляху 1 см; температура реакції 37С;
Автоматичні піпетки на 25 мкл та 1000 мкл;
Робочий реагент (субстрат – 10 ммоль/л у буфері (рН 10,10,1)).
Робочий реагент придатний застосування, якщо його оптична щільність вище 1,0 од.опт.плотн. за довжини хвилі 405 нм.
Перед аналізом реагенти слід прогріти до температури вимірювання (37С).
Додати в кювету
2. Робочий реагент
Перемішати вміст пробірки та увімкнути секундомір. Виміряти оптичну густину проби проти дистильованої води при довжині 405 нм рівно через 1 хв. Повторити вимір 3 рази з інтервалом 1 хв. Розрахувати зміну оптичної густини за кожну хвилину, а потім обчислити середній вимір оптичної густини за хвилину (о.п./хв).
Розрахунок за фактором активності ЛФ проводять за формулою:
де о.п./хв – середня зміна опт.щільн. за хвилину;
1,025 – загальний об'єм розчину у кюветі;
1000 - коефіцієнт перекладу мл в л;
18,75 –коефіцієнт мілімолярного поглинанняп-нітрофенолу;
0,025 – об'єм сироватки у мл;
1,0 – довжина оптичного шляху.
При внесенні будь-яких змін до цих параметрів фактор слід перерахувати. Якщо активність ЛФ перевищує 800 Е/л (точка поза зоною лінійності калібрувального графіка), сироватку, що аналізується, слід розвести 1:1 фізіологічним розчином і повторити вимірювання, а отриманий результат розрахунку помножити на 2.
Клініко-діагностичне значення:Збільшення активності ЛФ у сироватці крові спостерігається при кісткових захворюваннях. Це пов'язано з більш інтенсивним синтезом кісткового ізоферменту в остеобластах або зі збільшенням кількості самих остеобластів.
Найбільш висока активність ЛФ (вища за норму в 20 разів і більше) визначається при деформуючому оститі (хвороба Педжета), менш висока – при рахіті. Злоякісні захворювання кістки також характеризуються підвищеними рівнями активності ЛФ. При гіперпаратиреоїдизмі концентрація ферменту в сироватці підвищується незначно.
Різке збільшення активності ЛФ спостерігається при механічній жовтяниці. У меншій мірі активність ферменту підвищується при гепатиті та цирозі печінки. Підвищення активності ферменту в сироватці при захворюваннях печінки та жовчовивідних шляхів пов'язане з вивільненням печінкової ЛФ у кров із пошкоджених гепатоцитів, або із затримкою екскреції ізоферменту з жовчю при обструкції жовчовивідних проток.
Найбільш термостабільний та малорухливий при електрофорезі ізофермент ЛФ належить плаценті. Подібні властивості з ним має і ЛФ злоякісних новоутворень.