Визначення загального азоту в рослинах, розрахунок вмісту протеїну
Визначення вмісту загального азоту за К'єльдалем
Вміст білка у рослинах визначають за кількістю білкового азоту. Вміст білкового азоту (у відсотках) множать на коефіцієнт 6,25 при аналізі вегетативних органів та коренеплодів та на 5,7 при аналізі зерна.
Перед небілкових форм азоту посідає вегетативних органах 10-30% від загального азоту, а зерні - трохи більше 10%. Вміст небілкового азоту до кінця вегетації знижується, тому у виробничих умовах, особливо при аналізі кормів, часток небілкового
Принцип методу.Наважку рослинного матеріалу озолюють у колбі К'єльдаля концентрованою сірчаною кислотою у присутності одного з каталізаторів: металевого селену, перекису водню, хлорної кислоти тощо. Температура озоління 332° С. У процесі гідролізу та окислення органічної маси азот у колбі зберігається у розчині у вигляді сульфату амонію. Для звільнення аміаку використовують 40% розчин луги:
Відгін аміаку ведуть в апараті К'єльдаля при нагріванні та кипінні розчину. У кислому середовищі немає гідролітичної дисоціації сульфату амонію, парціальний тиск аміаку дорівнює нулю. У лужному середовищі відбувається зміщення рівноваги, і в розчині утворюється аміак, який при нагріванні легко випаровується:
Аміак не втрачається, а переходить по холодильнику спочатку у вигляді газу, а потім, конденсуючись, краплями потрапляє до приймача з титрованою сірчаною кислотою і зв'язується нею, знову утворюючи сірчанокислий амоній:
Надлишок кислоти, не пов'язаний з аміаком, відтитрується лугом точно встановленої нормальності за комбінованим індикатором або метилротом.
На аналітичнихвагах взяти навішування рослинного матеріалу 0,3 - 0,5 ± 0,0001 г за допомогою пробірки (по різниці між вагою пробірки з наважкою та вагою пробірки з залишками матеріалу) і, надівши на кінець пробірки гумову трубку довжиною 12-15 см, обережно опустити навішування на дно колби Кьєльдаля. Налити в колбу невеликим циліндром 10-12см 3 концентрованої сірчаної кислоти (d = 1,84). Рівномірне озоління рослинного матеріалу починається вже за кімнатної температури, тому залиті кислотою навішування краще залишити на ніч.
Поставити колби на електроплитку або спеціальну установку і проводити поступове спалювання спочатку на слабкому вогні (покласти азбест), потім на сильному, періодично обережно збовтуючи. Коли розчин стане однорідним, додати каталізатор (кілька кристалів селену або кілька крапель перекису водню) та продовжити спалювання до повного знебарвлення розчину.
Відгін аміаку.Після закінчення спалювання колбу К'єльдаля охолоджують і в неї обережно приливають по стінках дистильовану воду, перемішують вміст і обполіскують шийку колби. Першу порцію води наливають до шийки і кількісно переносять у круглодонну колбу ємністю 1 дм 3 . Колбу Кельдаля ще 5 - 6 разів промивають невеликими порціями гарячої дистильованої води, зливаючи щоразу промивні води у відгінну колбу. Наповнюють відгінну колбу промивними видами до 2/3 її обсягу і додають 2-3 краплі фенолфталеїну. Невелика кількість води ускладнює пароутворення при відгоні, а велика може викликати перекидання окропу в холодильник.
У конічну колбу або хімічну склянку ємністю 300 -400 см 3 (приймач) наливають із бюретки 25-30 см 3 0,1 н. H2SO4 (з точно встановленим титром) додають 2-3 краплі індикатора метилрота або реактиву Гроака (лілове забарвлення).Кінчик трубки холодильника занурюють у кислоту. Відгінну колбу ставлять на нагрівач і приєднують до холодильника, перевіряючи герметичність з'єднання. Для руйнування сірчанокислого амонію і відгону аміаку використовують 40% розчин луги, взятий в такому обсязі, який в чотири рази перевищує обсяг концентрованої сірчаної кислоти, взятої при спалюванні проби (при 10 см 3 кислоти беруть 40 см 3 луги).
Відгінну колбу прямо на нагрівачі відкривають, нахиляють, у лівій руці утримують колбу та пробку холодильника. У колбу по стінці доливають відмірену кількість лугу так, щоб вона опустилася на дно колби, і пробку холодильника швидко закривають. Це викликано тим, що реакція взаємодії лугу та сульфату амонію починається і без нагрівання, що призводить до втрат аміаку. Шийка колби не можна по всій поверхні заливати лугом, так як пробка холодильника вискочить при кип'ятінні.
Закриту колбу обережно і ретельно збовтують круговими рухами, при цьому в склянку-приймач проскакують спочатку бульбашки повітря. Розчин у колбі спочатку стає червоного кольору, потім темніє, і при нагріванні з'являється об'ємний осад. Включають нагрівач і холодильник і приступають до відгону аміаку. Через 20 -25 хв після початку відгону опускають склянку-приймач так, щоб розчин аміаку з холодильника стікав по стінці склянки. Кипіння у відгінній колбі має бути рівномірним і досить інтенсивним,
інакше кислота зі склянки засмоктуватиметься в холодильник за рахунок перепаду внутрішнього та зовнішнього тиску газів. Якщо засмоктування почалося, треба посилити нагрівання відгінної колби і вийняти кінець трубки холодильника з розчину кислоти, для цього опустити склянку-приймач.
Відгін вважати закінченим, коли вміст відгінної колби випаруєтьсядо 1/3 початкового обсягу. Повноту відгону аміаку перевіряють універсальним індикатором, лакмусом або реактивом Несслера, навіщо беруть кілька крапель з холодильника на індикаторну папір чи пробірку, куди доданий реактив Несслера. Він дає з аміаком жовте забарвлення.
Якщо в процесі відгону рідина в приймачі змінить забарвлення, необхідно додати фіксовану кількість 0,1 н. H2SO4 (20 см 3 ), оскільки початкового об'єму кислоти не вистачило для зв'язування аміаку.
Після закінчення відгону носик холодильника споліскують дистильованою водою з промивалки до приймача.
Вміст приймача титрують 0,1 н. розчином їдкого калі, перемішуючи обережно скляною паличкою, до переходу забарвлення метилового червоного в безбарвне, а за реактивом Гроака - від лілового до світло-зеленого. Тут інтенсивність забарвлення залежить кількості індикатора.
Кількість аміакузнаходять по різниці між кількістю кислоти в приймачі, спочатку прилитої, і кількістю кислоти, яка не зв'язалася з аміаком і відтитрована згодом лугом.