2 Методи дослідження морфіну та трамадолу в судово-хімічному аналізі
Стандартні та калібрувальні розчини.
Для калібрування готували стандартні (1 мг/мл) розчини морфіну (Ам), трамадолу (Ат), бупренорфіну (Аб) (внутрішній стандарт) ваговим методом із стандартних речовин: морфін гідрохлориду, трамадолу та бупренорфін гідрохлориду.
Зразки плазми для побудови калібрувальних графіків та контролів негативних результатів отримані у центрі переливання крові.
Робочий розчин бупренорфіну (внутрішній стандарт) з концентрацією 0,04 мг/мл готували зі стандартного розчину бупренорфіну (1 мл розчину Аб поміщали в градуйовану колбу місткістю 25 мл і доводили до 25 мл метанолом). Зберігали у морозильній камері (-400С протягом 3 місяців).
Калібрувальні розчини, що містять бупренорфін, що використовується як внутрішній стандарт, в концентрації 0,8 мг/л крові і морфін в концентраціях: 0,02 мг/л, 0,04 мг/л, 0,2 мг/л, 0,4 мг/л, 2 мг/л, 4 мг/л крові (розчини I-VI відповідно) готували з розчинів морфіну з концентрацією 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0, 01 мг/мл та з розчину бупренорфіну з концентрацією 0,4 мг/мл.
При проведенні процедури калібрування до 1 мл сироватки додавали по 20 мкл калібрувальних розчинів (I-VI).
Калібрувальні розчини, що містять бупренорфін, що використовується як внутрішній стандарт у концентрації 0,8 мг/л крові і трамадол у концентраціях 0,02 мг/л, 0,05 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5 мг/л , 1 мг/л, 2 мг/л крові (розчини I-VI відповідно) готували з розчину трамадолу з концентрацією 1,0 мг/мл (розчин Ат) та з розчину бупренорфіну з концентрацією 1,0 мг/мл.
Приготовані розчини зберігали в морозильній камері (-400С протягом 3 місяців).
Під час проведення процедурикалібрування до 1 мл сироватки додавали по 50 мкл калібрувальних розчинів (I-VI).
Пробопідготовка.
1 мл крові вносили в пробірку (15 мл), додавали 1мл ацетатного буфера рН 4,8 та 25 мкл-глюкуронідази Helix Pomatia, герметично закривали та витримували протягом 18 годин при 37°С. До гідролізату додавали 20 мкл розчину бупренорфіну (внутрішній стандарт) 0,04 мг/мл, струшували на шейкері IKA MS1 10 с і додавали 0,3 мл трис-буфера (1М). Зразок екстрагували 4 мл суміші метилен-хлористий - ізобутанол (9:1) інтенсивно струшуючи 10 хвилин на шейкері IKA HS501 (300 колив./хв). Центрифугували 5 хвилин при 4000об/хв. 3 мл органічної фази переносили у віалу. Екстракт випарювали під струмом азоту в концентраторі екстрактів. У флакон із сухим залишком за допомогою шприца вносили 100 мкл реактиву біс(триметилсиліл)трифторацетамід (БСТФА) + 1% триметилхлорсилану (ТМС), флакон герметично закривали, ретельно струшували, нагрівали в термостаті 20 хвилин при 50-С мас-спектрометрії.
Паралельно, за вищевказаних умов проводили:
- екстракцію крові, що не містить морфіну, трамадолу та бупренорфіну;
- контрольних проб, що містять морфін та трамадол у концентраціях у межах від 0,02 до 4 мг/л та від 0,02 до 2 мг/л відповідно.
Нами було вивчено вплив ферментативного гідролізу з використанням глюкуронідази Helix Pomatia. Дослідження проводили із реальним зразком крові. В результаті аналізу даного зразка за вищеописаною методикою знайшли морфін (в концентрації 1,22 мг/л) і трамадол (в концентрації 0,97 мг/л). Надалі цей зразок досліджували 10 разів: у 5 випадках пробопідготовка проходила без проведення ферментативного гідролізу -глюкуронідазою Helix Pomatia і в 5 випадкахзгідно з наведеною методикою. % виходу для морфіну без проведення гідролізу становив 21 %, а трамадолу 77 % (дані кількісного визначення представлені на малюнках 5 і 6).