Антигенрозпізнавальні рецептори Т-клітин
Вивчення процесу розпізнавання антигену В-клітинами не викликало спеціальних експериментальних ускладнень. Легкість виявлення мембранного імуноглобуліну даного клітинного типу давала до рук дослідників основу для детального аналізу явища. При цьому пошук аналогічних структур у Т-клітин зіткнувся із певними труднощами. Використання тих же експериментальних підходів, які застосовувалися щодо антигенних рецепторів у В-клітин, не призвело до позитивних результатів. Перші кроки до вирішення проблеми були зроблені, як це не дивно, не в молекулярній імунології, а в клітинній — в експериментах з клітинами, що генетично відрізняються, взаємодіючими in vitro.
Спочатку в гіпотетичній, на підставі клітинної феноменології, а потім в експериментально добре документованій формі з використанням методів молекулярної біології було встановлено, що Т-клітинний рецептор розпізнає власне не чужорідний антиген, а його комплекс з білками, контрольованими головним комплексом гістосумісності (МНС). Основні докази подвійного розпізнавання: молекул І та ІІ класів МНС та асоційованого з ними антигенного пептиду, отримані Р. Цінкернагелем та П.Дохерті. Дослідження цих учених було відзначено присудженням Нобелівської премії з медицини за 1997р.
Будування Т-клітинних антигенрозпізнаючих рецепторівВідомо два типи Т-клітинних антигенрозпізнаючих рецепторів: TCRaB та TCRyb (від англ. - T cell receptor, TCR). Останній експресується на мінорній субпопуляції Т-клітин (Тyb), які у невеликій кількості представлені в тимусі та на периферії – у селезінці, крові. В онтогенезі вони передують Т-клітин з TCRaB (TaB). Для їх дозрівання не потрібний тимус, вони здатні до самовідтворення, беруть участь уантибактеріальний захист, реагуючи на вуглеводні компоненти. Філогенетично Тyb передували ТaB.
Спроби виявити TCR за допомогою антиімуноглобулінових антитіл, як це було зроблено при пошуку антигенрозпізнаючих структур у В-клітин, виявилися безуспішними. Ідентифікувати TCR вдалося лише із застосуванням моноклональних антитіл (мАТ) та клонованих ліній Т-клітин. Деякі клоноспецифічні мАТ реагували лише з клонами, виділеними від попередньо імунізованих тварин. Внесення в культуру таких клонів, що відповідають за специфічністю мАТ, пригнічувало здатність клонованих Т-клітин розпізнавати антиген, використаний для імунізації. Наявність подібних антигенспецифічних мАТ забезпечило повноцінне вивчення антигенних структур Т-клітин.
Кожна функціонально зріла Т-клітина має близько 3 • 104 TCR. Вони являють собою гетеродимер, побудований для більшості клітин з ос-і (3-ланцюгів, ковалентно пов'язаних між собою цистеїновим містком. Кожен ланцюг складається з варіабельного V-домену і константного С-домену, гомологічних відповідним доменам імуноглобулінів. У структурі TCR представлений шарнірний домен з цистеїновим залишком, який утворює дисульфідний місток, що об'єднує а- і B-ланцюгів єдиних молекул. ь коротким цитоплазматичним хвостом, зануреним у цитоплазму, наявні структурні відмінності між TCRu BCR не можуть вважатися визначальними, оскільки основна властивість — побудова активної антигенної ділянки за рахунок процесів рекомбінації тавзаємодії двох V-доменів залишається загальним.
Генетичний контроль структури Т-клітинного антигенрозпізнаючого рецептораОрганізація генів, що кодують а- і B-ланцюги TCR, в основному гомологічна тій, яка відома для легких і важких ланцюгів імуноглобулінів. V-домен ос-ланцюга, подібно до легкого ланцюга імуноглобулінів, контролюється тільки V- і J-генними сегментами. У той же час утворення V-домена B-ланцюга, як і важкого ланцюга імуноглобулінів, забезпечене повним набором V-, D-, J-генних сегментів.
У геномі Т-клітин є більше 100 V-генів для а-ланцюга TCR, що в два з половиною рази менше тієї кількості, яка відома для легких ланцюгів імуноглобулінів. Кожен такий ген включає два екзони - один для лідерної (L) послідовності, що відсутня у зрілої а-ланцюга, але представленої у цієї ланцюга в момент її транспорту з ендоплазматичного ретикулуму до клітинної поверхні, і другий - для кодування власне V-домену TCR. J-генних сегментів для а-ланцюга значно більше, ніж для легкого ланцюга імуноглобулінів (100 проти 4). Константна область а-ланцюга контролюється С-геном, що включає окремі екзони для С-домену та шарніру і один загальний екзон - для трансмембранної та хвостової частин молекули.
Кількість V-генів для B-ланцюга дорівнює 30. Крім того, є два кластери DJC. Кожен кластер включає один D- та шість активних J-генних сегментів. Функціональні різницю між кластерами невідомі. С-ген для константної області B-ланцюга включає чотири екзони для константної, шарнірної, трансмембранної та хвостової ділянок поліпептиду. Процеси рекомбінації, транскрипції, сплайсингу та трансляції генетичного матеріалу для а- та Р-ланцюгів при утворенні TCR у Т-клітинах аналогічні тим, які забезпечують синтез імуноглобулінів у В-клітинах.
Так само як і у випадку з імуноглобулінами та імуноглобуліновими рецепторами, варіабельність TCR залежить від випадкової взаємодії генних сегментів у процесі рекомбінації генетичного матеріалу, що кодує V-домени: VJ – для а-ланцюгів та VDJ – для B-ланцюгів, а також за рахунок тих додаткові зміни, які, як і у випадку з BCR, супроводжують рекомбінацію. Виняток становить відсутність соматичного мутагенезу у V-генах. Розрахунок варіабельності V-доменів TCR, який проводиться так само, як і для імуноглобулінів, показує вкрай високий рівень різноманітності цих антигенних структур. Так, лише наявність у геномі нерекомбінованих V-, D- та J-генних сегментів дає потенційно (без урахування модифікацій при реорганізації) 2,8-106 варіантів.
Імуноглобуліни та імуноглобулінові рецептори В-клітин розпізнають нативні антигенні епітопи. У зв'язку з цим окремі ділянки антиген-розпізнаючого центру мають рівні шанси на мінливість. Ситуація з TCR дещо інша, оскільки цей рецептор розпізнає комплекс антигенного пептиду з молекулами МНС.
Різноманітність TCR пов'язана значною мірою з третьою петлею V-домену, що формується третьою гіперваріабельною ділянкою - CDR3 (від англ. - Complementary determining region). При утворенні антигенсвязующего центру CDR3 виявляються у його внутрішній частині. Перша та друга петлі – CDR1 та CDR2 – займають відповідно периферію центру. У такій конформаційній побудові є цілком певний біологічний зміст, пов'язаний з адаптацією TCR до форми імуногену, з якою він взаємодіє. Антигенні пептиди заповнюють простір (щілину), утворений аспіральними структурами молекул МНС, і таким чином виявляються в середині антигенного комплексу пептид: МНС. Подібний комплексхарактеризується величезним безліччю антигенних специфічностей, пов'язаних з пептидами, та обмеженою різноманітністю, властивою молекулам МНС. У зв'язку з подібною організацією імуногенного комплексу слід очікувати підвищену мінливість CDR3 та меншу мінливість CDR1 та CDR2. Вивчення генетичної організації генів для TCR підтверджує таку думку. Так, TCR має значно меншу в порівнянні з імуноглобулінами кількість V-генів, що визначають специфічність CDR1 і CDR2, але при цьому збільшена кількість J-cer-ментів, що беруть участь у кодуванні CDR3.
TCR, як і мембранний антиген-розпізнавальний імуноглобулін В-клітин, має дуже короткий цитоплазматичний хвіст. У зв'язку з цим сигнал від взаємодії TCR з комплексом пептид: молекули МНС може бути переданий всередину клітини. Трансмісивну функцію виконують інваріантні, низькомолекулярні, асоційовані з TCR білки, які отримали загальну назву CD3. Комплекс CD3 включає п'ять білків: білки CD3y, CD3b та CD3e представлені на клітинній поверхні і мають певну гомологію з імуноглобулінами, цитоплазматичні білки CD3? та CD3n не мають такої гомології.
Білки, гомологічні імуноглобулінам, експресуються на клітинній поверхні у вигляді гетеродимерів CD3e6 та CD3ey. Їх зв'язок з TCR здійснюється за допомогою електростатичного тяжіння. Негативно заряджені трансмембранні ділянки ланцюгів CD3 взаємодіють із несучими позитивний сумарний заряд трансмембранними ділянками TCR. Наявність довгого хвоста дозволяє взаємодіяти з цитоплазматичними білками-трансдукторами після отримання антигенного сигналу.
Два інші поліпептиди - CD3t і CD3n - також входять до складу комплексуу вигляді димерів СС або Сn- Близько 80% TCR асоційовано з гомодимером і лише 20% з гетеродимером. Функціональні різницю між ними невідомі. Основний домен цих білків, на відміну від інших СОЗ-білків, знаходиться в цитоплазмі. Саме головна, а чи не хвостова частина З і n взаємодіє у цитоплазмі з білками-трансдукторами.
Крім сигналу передавальної функції білки CD3 відповідальні за транспорт TCR до клітинної поверхні. У мутантних клітин, у яких відсутній синтез у-, b- або е-ланцюгів, експресія TCR повністю пригнічена, хоча внутрішньоклітинний синтез цих рецепторів не порушений. При мутаціях гена С-ланцюга вихід TCR на клітинну поверхню відбувається меншою мірою порівняно з нормою. Як трансмісивна, так і транспортна функції CD3 білків гомологічні тій, що характерна для Iga- та Igp-білків імуноглобулінового, антигенрозпізнаючого комплексу.
В активації Т-клітин, що розпізнали антиген, беруть участь також корецептори CD4 та CD8 – маркери диференціювання Т-клітин. Як зазначалося, перший їх є маркером CD4+ Т-клітин, другий — цитотоксичних Т-лімфоцитів (CD8+ Т-клітин). Довгий час функція цих білків залишалася невідомою. Виявилося, що вони беруть безпосередню участь у взаємодії TCR з відповідним лігандом як корецептор.
CD4 є одноланцюговою молекулою, що складається з чотирьох імуноглобулінподібних доменів (рис. 4.9). Домени D1 і D2, а також D3 і D4 утворюють між собою парні, щільно запаковані, жорсткі структури. Ці пари з'єднані гнучкою шарнірною ділянкою. Хвостова частина молекули CD4 має достатню довжину для взаємодії з цитоплазматичними білками-трансдукторами. На клітинній поверхні TCR та CD4 представлені незалежно один від одного. Їхня зустрічвідбувається у процесі формування відповіді антиген. Після розпізнавання антигенного комплексу TCR відбувається взаємодія CD4 з молекулою II класу МНС. Реакція взаємодії здійснюється між В2-доменом молекули II класу МНС та першим доменом CD4. Передбачається також слабке включення у взаємодію та другого домену D2.
Аналогічна картина спостерігається під час розпізнавання антигенного комплексу цитотоксичними Т-лімфоцитами (ЦТЛ). Діючі учасники взаємодії – TCR цитотоксичних Т-лімфоцитів, комплекс пептиду з молекулою І класу МНС та маркер цитотоксичних Т-лімфоцитів – CD8. CD8, хоч і виконує подібну до CD4 функцію корецептора, структурно відрізняється від маркера Т-хелперів. Він являє собою гетеродимер, кожен ланцюг якого включає один імуноглобулінподібний домен і досить довгу, пов'язану з мембраною ділянку ланцюга, яка піддається значним конформаційним змінам. Як і CD4, CD8 представлений на клітинній мембрані незалежно. Його функція корецептора реалізується у процесі антигенного розпізнавання. Після взаємодії TCR з антигенним лігандом відбувається контакт а-і Р-доменів CD8 з а3-доменом молекули І класу МНС. Молекулярний комплекс, що утворився, є умовою передачі через корецептор CD8 сигналу всередину клітини.
Внутрішньоклітинні події, що визначають активацію Т-клітин, аналогічні тим, що відбуваються у В-клітинах після антигенної стимуляції. Агрегат, що утворився з антигенпредставляють молекул МНС, Т-клітинного рецепторного комплексу, що включає CD3 молекули, і CD4 або CD8 молекул провокує внутрішньоклітинну взаємодію різних тирозинкіназ з цитоплазматичною частиною поліпептидів. Серед СDЗ-білків найбільшу зв'язуючу активність має CD3?, представлений у цитозолі нехвостовий, а головною частиною. Активовані внаслідок взаємодії кінази забезпечують каскад реакцій, наслідком яких є індукція специфічної транскрипції генів. Серед генів, що вступили у процес транскрипції, особливе місце посідають ті, що кодують синтез Т-залежних цитокінів (зокрема, ІЛ-2). Зрештою ланцюг подій від взаємодії TCR з антигенним комплексом та утворення складного молекулярного агрегату до внутрішньоклітинних реакційних перетворень призводить до проліферації.
В- і Т-клітини мають самостійні антигенрозпізнавальні рецептори, що відносяться до одного і того ж суперродини імуноглобулінів. Антигенрозпізнавальні рецептори В-клітин (BCR) є мономерною формою IgM, модифікованою додатковою послідовністю амінокислотних залишків у С-кінцевій частині молекули. Ця послідовність складає трансмембранний та хвостовий ділянки важкого ланцюга. Т-клітинний антигенрозпізнавальний рецептор (TCR) складається з двох поліпептидних ланцюгів, кожен з яких включає два домени: V і С. Механізм генетичного контролю V-доменів як BCR, так і TCR в цілому подібний і включає процес випадкової рекомбінації генних сегментів (V, D, J). Незважаючи на те, що функціональне призначення антигенрозпізнаючих рецепторів двох типів клітин те саме (розпізнавання чужорідності), реалізація такої функції В- і Т-клітинами здійснюється різними способами. В той час, як slg В-клітин розпізнає власне антигенну детермінанту без будь-яких додаткових умов, TCR Т-клітин здатний розпізнати тільки комплекс антигенної детермінанти з власними молекулами І або ІІ класу МНС.