Біолюмінесценція

Біолюмінесценція- здатність живих організмів світитися, що досягається самостійно або за допомогою симбіонтів. Назва походить від грецького слова "біос", що означає життя, і латинського "люмен" - світло. Світло створюється у більш високо розвинених організмів у спеціальних органах, що світяться (напр., у фотофорах риб), у одноклітинних еукаріотів — в особливих органоїдах, а у бактерій — у цитоплазмі. Біолюмінесценція ґрунтується на хімічних процесах, при яких енергія, що звільняється, виділяється у формі світла. Таким чином, біолюмінесценція є особливою формою хемілюмінесценції.

біолюмінесценції

Зміст

Піонером у дослідженні механізмів біолюмінесценції став Рафаель Дюбуа, в 1887 р., який поставив експеримент з екстрактами з жуків, що світятьсяPyrophorus- він виявив, що екстракт тканин фотофорів світляків, отриманий гомогенізацією в холодній воді, світиться в проте екстракт, приготований у гарячій воді, не світиться. Разом з тим Дюбуа виявив, що якщо додати до згаслого холодного екстракту порцію гарячого екстракту, що не світиться, то світіння відновлюється. Таким чином, за світіння були відповідальні дві фракції: стійка до нагрівання низькомолекулярна і білкова, що втрачає активність при нагріванні; світінняin vitroвиникало лише у присутності обох фракцій та у присутності кисню. Аналогічні результати Дюбуа отримав і при експерименті зі двостулковими молюсками, що світяться,Pholas dactylus. Така поведінка типова для систем ферментів - субстрат, тому Дюбуа назвав низькомолекулярну фракцію люциферином, а білкову - люциферазою і постулював ферментативну природу реакцій, що викликають біолюмінесценцію [2] [3] .

Роботи Дюбуа поклали основу для подальших робіт уДослідженні біолюмінесценції виявилося, що у різних груп організмів існує безліч систем люциферин - люцифераза.

Едмунд Ньютон Харві (Edmund Newton Harvey) у Прінстонському університеті розпочав роботи з вивчення біолюмінесценції ракоподібних. У 1920 р. Харві показав відмінність люциферазних субстрат-ферментних систем різних таксонів: люциферин молюсківPholasне світився під дією люциферази ракоподібнихCypridinaі навпаки, люциферазаPholasбула неактивна по відношенню до люциферинуCypridina.

У 1957 р. було виділено і охарактеризовано люциферин світляків, що виявився похідним тіазолу [4] .

Наприкінці 1950-х — на початку 1960-х Осаму Симомура в університеті Нагоя досліджував механізм світіння остракодCypridina hilgendorfii, які використовувалися під час Другої Світової Війни японцями як природний люмінофор: висушені рачки при змочуванні знову починали світитися. Йому вдалося виділити з них у чистому кристалічному стані новий люциферин, який відрізняється від люциферину світляків [5] . Як об'єкт подальших досліджень біолюмінесценції в Прінстоні він обрав медузуAequorea victoria, фотофори якої випромінюють зелене світло. Симомура виділив з медуз екворин - білок, що містить імідазопіразин целентеразин і показав, що біолюмінесценція екворину ініціюється іонами кальцію, при цьому, на відміну від класичної біолюмінесценції, для випромінювання світла екворином кисень не був потрібний. Це стало відкриттям нового класу біолюмінесцентних систем — фотопротеїнів, у яких світловипромінюючий фрагмент не є вільним субстратом — люциферином, а простетичною групою, міцно пов'язаною з білком.

Симомура також виявив, що виділений з медузи та очищений екворинin vitroвипромінює синійсвітло, тоді як жива медуза світиться зеленим. Подальші дослідження показали, що за зелене світіння відповідальний інший білок - GFP ( green fluorescent protein - зелений флуоресцентний білок), що флуоресціює зеленим світлом під дією блакитного випромінювання екворину; і екворин, і GFP надалі увійшли в лабораторну практику молекулярної біології, перший як індикатор присутності іонів Ca 2+ , другий як флуоресцентна мітка для вивчення експресії клітинних білків. За роботи з GFP Сімомур був удостоєний нобелівської премії з хімії 2008 року.

Хемілюмінесценція виникає при багатьох хімічних реакціях - наприклад, при рекомбінації вільних радикалів або в реакціях окислення (при вільнорадикальному окисленні парів білого фосфору в газовій фазі, окисленні люмінолу у водному розчині тощо). У цьому випадку, як і в реакціях біолюмінесценції, енергія, що виділяється, не розсіюється у вигляді тепла, як це відбувається в ході більшості екзотермічних хімічних реакцій, а витрачається на утворення одного з продуктів реакції у збудженому електронному стані. Для випромінювання світла в ході хемілюмінесцентної реакції необхідно виконання як мінімум двох умов: по-перше, енергія, що виділяється в ході реакції повинна перевищувати

41-71,5 ккал/моль і, по-друге, різниця енергій основного та збудженого стану продукту реакції повинна бути нижчою за ентальпію хімічної реакції.

При дотриманні цих умов можливе утворення з досить високим виходом окисленої форми люциферину у збудженому стані та подальший перехід в основний стан з випромінюванням фотона видимого спектрального діапазону. Відношення числа випромінюваних фотонів до загальної кількості елементарних актів реакції називається квантовим виходом реакції, квантові виходибіолюмінесценції, на відміну від більшості хемілюмінесцентних реакцій, дуже високі та досягають значень 0,1-1. Такі квантові виходи для реакцій, що протікають у водних розчинах при нейтральних значеннях pH, незвичайні для хемілюмінесцентних процесів і обумовлені специфічною ферментативною природою окисних реакцій біолюмінесценції, що каталізуються люциферазними комплексами.

Довжина хвилі випромінюваного при біолюмінесцентних процесах світла залежить від різниці енергій основного і збудженого станів окислених форм люциферинів і пов'язана з нею відношенням \(\Delta E = h \nu\), напівширина смуги випромінювання становить зазвичай

50 нм. Оскільки процес переходу збуджений - основний стан оборотний, то спектри флуоресценції оксилюциферинів близькі до спектрів біолюмінесценції: в обох випадках випромінює молекула оксилюциферину, переведена в збуджений стан або внаслідок хімічної реакції (біолюмінесценція), або внаслідок поглинання достатньо енергій.

Разом з тим, максимум у спектрі випромінювання в біолюмінесцентних процесах може змінюватись залежно від умов перебігу реакції. Наприклад, незважаючи на те, що хімізм біолюмінесценції жуків-світляків однаковий і структури люциферину та оксилюциферину різних видів ідентичні, колір світіння може варіювати від зеленого до червоного, тобто максимум у спектрі випромінювання може змінюватися від 490 до 622 нм. Більше того, у личинок бразильських жуків-фенгонід роду є кілька органів-фотофорів, що випромінюють світло різних відтінків — червоного фотофора голови і жовто-зеленого фотофора черевця [6] . Така зміна спектра випромінювання можлива, коли оксилюциферин може існувати в декількох формах з різною енергією основного стану, що, у свою чергу,відповідає енергіям переходу зі збудженого стану і, внаслідок цього, до різних максимумів у спектрі випромінювання при переході зі збудженого стану в основне.

Оксилюциферин світляків здатний до кето-енольної таутомерії та в розчинах існує у вигляді суміші кетонної та енольної форм. Відношення кількостей кето- та єнольних таутомерів залежить від pH середовища: у слаболужних умовах (pH 7.5 - 7.8 і вище) переважає єнольна форма, при цьому максимум у спектрі біолюмінесценції припадає на 587 нм, тобто на жовто-зелену область, при закисленні середовища ( pH [7].

Іншим фактором, що впливає на спектр біолюмінесценції, є мікрооточення молекули оксилюциферину в основному та збудженому станах. На значення енергетичних рівнів основного і збудженого станів молекули оксилюциферину в середовищі впливає і енергія їх взаємодії з розчинником (енергія сольватації), і утворення водневих зв'язків: чим сильніше збуджена молекула асоційована з мікрооточенням і тим вище його поляриозність, тим нижче менше енергія фотона, що випускається, і тим сильніше зсув максимуму спектра випромінювання в довгохвильову область.

Третім фактором, що впливає на енергію збудженого стану оксилюциферину і, відповідно, спектральний максимум є релаксаційні процеси мікрооточення. При відщепленні CO2 від 1,2-діоксетанового попередника оксилюциферину світляків відбувається дуже швидка перебудова електронної структури молекули та різка зміна її дипольного моменту, при цьому збуджена молекула виявляється у сольватній оболонці молекули – попередниці. Час життя молекули осилюциферину у збудженому синглетному стані становить

10 −9 −10 −8 секунди, і якщоза цей час молекули розчинника або навколишні активний центр білкові ланцюги люциферази не встигають переорієнтуватися в новий рівноважний стан, то енергія збудженого стану оксилюциферину виявляється максимальною, а максимум спектру зрушений в короткохвильову область, тобто довжина хвилі випромінюваного мікровимірювання у тому числі від рухливості білкових ланцюгів люциферази [7] .

І, нарешті, особливим випадком, що веде до зміни спектру біолюмінесценції, є перевипромінювання енергії, що виділяється при окисленні люциферинів, флуоресцентними білками - такий механізм спостерігається у деяких бактерій і медуз, що люмінескують, і призводить до зміщення спектрального максимуму в довгохвильову область. У бактерій, у клітинах яких є жовтий флуоресцентний білок (YFP, англ. yellow fluorescent protein ) передбачається індуктивно-резонансне міжмолекулярне перенесення енергії (механізм Ферстера) від люциферин-люциферазного комплексу до флуоресцентного білка. Цей механізм може відігравати істотну роль і ставати основним механізмом біолюмінесценції: було показано, щоin vitroпри додаванні до целентеразинової люциферин-люциферазної системи поліпів-альцінарійRenilla reniformis, що випромінює з максимумом 480 нм , зеленого флуоресцентного білкаRenillaквантовий вихід люмінесценції на довжині хвилі GFP 510 нм підвищується втричі [9] .

Як уже згадувалося, необхідною умовою біолюмінесценції є висока ентальпія реакції окиснення люциферину: енергія, що виділяється в ході реакції, повинна перевищувати

41-71.5 ккал/моль, що відповідає енергіям електромагнітного випромінювання у видимому діапазоні

400-700 нм, ця енергія можна порівняти з енергією зв'язку C-C в алканах (

79 ккал/моль). Такий енергетичний ефект значно перевищує енергетичні ефекти більшості біохімічних реакцій – у тому числі й за участю макроергічних сполук – носіїв енергії у живих системах; так, наприклад, енергія, що вивільняється при гідролізі АТФ до АМФ, становить 10.9 ккал/моль.

Енергія, що відповідає енергіям видимого спектру, в живих системах може бути отримана тільки в реакціях одностадійного окислення за участю молекулярного кисню (або активних форм кисню), тому більшість люцифераз відносяться до класу ферментів - оксигеназ, що каталізують реакції, в яких відбувається приєднання кисню люциферину (за небагатьма винятками люцифераз кільчастих черв'яків, що мають пероксидазоподібну активність) і, відповідно, всі організми, що світяться, є аеробами.

Більшість люциферинів при окисленні утворюють циклічні напружені проміжні пероксиди - діоксетанони, в яких валентні кути в чотиричленному циклі істотно відрізняються від нормальних валентних кутів, такі сполуки далі розпадаються з виділенням молекули вуглекислого газу і утворенням збудженого. Такий механізм реакції характерний для окислення люциферину комах та целентеразинів – люциферинів багатьох морських організмів.

В даний час відомо п'ять класів люциферинів різної хімічної природи: альдегід-флавінова система бактерій, альдегідні люциферини черв'яків, тетрапіроли динофлагелят і деяких ракоподібних, імідазопіразоли різних морських організмів і люциферин комах - похідне.

Біолюмінесценція виконує такі біологічні функції:

  • залучення видобутку чи партнерів
  • комунікація
  • попередження чи загроза
  • відлякування чи відволікання
  • маскування на тлі природних джерел світла

У багатьох випадках функція біолюмінесценції в житті окремих організмів, що світяться, з'ясована не до кінця, або взагалі не вивчена.