ДИФЕРЕНЦІЙНА ДІАГНОСТИКА УТОПЛЕННЯ З ДОПОМОГЮ МАС- СПЕКТРОМЕТРА MALDI BIOTYPER
Щорічно в Республіці Татарстан понад 200 людей гине від утоплення. У цьому більшість їх перебувати у віці від 18 до 45 років, переважають чоловіки і близько 70% перед зануренням у воду вживали алкогольні напої [4].
В якості лабораторного методу дослідження для діагностики утоплення в судовій медицині України використовується визначення діатомових водоростей в органах потонулих. 2,3]. Проте, за результатом аналізу діатомового методу, застосованого в медико-криміналістичному відділенні ДАУЗ «Республіканське бюро судово-медичної експертизи Міністерства охорони здоров'я Республіки Татарстан» (ДАУЗ «РБ СМЕ МОЗ РТ»), діатомеї були виявлені в нирках і кістковому мозку. Дані судово-медичних експертів м. Вітебськ ще нижчі і становлять 23% [5]. У зв'язку з цим нам є необхідним пошук більш результативних лабораторних методів. З цією метою для виявлення біологічних маркерів утоплення нами було випробувано мас-спектрометр MALDI BioTyper (BrukerDaltonik, Німеччина), що дозволяє проводити ідентифікацію мікроорганізмів методом визначення білкового профілю клітин.
Матеріал та методи
Об'єктами дослідження були кров із лівої половини серця, кров із правої половини серця, кров із стегнової вени трупа, вода з водоймища, в якій знаходилося тіло померлого. Кров і воду набирали стерильними одноразовими шприцамінами 2 мл. Подальше дослідження проводили з урахуванням Міждисциплінарного Центру Протеомних Досліджень, Казанського (Приволзького) федерального університету. З доставленогооб'єму крові (або води) відбирали 20-40 мклі поміщали в 3-4 мл живильного середовища Luria-Bertani(LB)і/або Кінга Б. Культивування проводили в пробірках протягом 16-18 годин при кімнатній температурі або в інкубаційній шафі при температурі +28 ° C і інтенсивності гойдання 50-70 об / хв. Для отримання ізольованих колоній стерильною петлею невелику кількість матеріалу розсівали штриховими рухами на твердому живильному середовищі LB та/або Кінга Б. Чашки інкубували в термостаті при оптимальній температурі (+28°C) протягом 12 годин.
Склад живильного середовища LB на 1 л: 10 гтриптону, 5 г екстракту дріжджового, 5 гNaCl. Тверде живильне середовище LB додатково містило 15 гагар. Склад живильного середовища Кінга Бна 1 л: 20 г пептону, 1.9 г K2HPO4'3H2O, 2.8 г MgSO4'7H2O, 8 мл 100% гліцерину. Тверда живильне середовище Кінга Бдодатково містила 15 гагар.
Ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару, вивчали візуально, звертали увагу на величину, форму, колір, характер країв та поверхні колоній, їхню консистенцію та інші відмітні ознаки. Далі проводили аналіз за стандартною методикою: до 10 одиничних колоній з кожної чашки наносили на ціль приладу microflexMaldiBioTyper(BrukerDaltonics, Німеччина). На зразок нашарували 1 мкл розчину матриці (α-ціано-4-гідроксикорична кислота). Після висихання, мета із зразками поміщали в прилад - настільну MALDI-TOF систему microflexMaldiBioTyper і отримували спектри константних білків невідомих мікроорганізмів.
Мас-спектрометричний аналіз проводили з використанням програмного забезпечення MALDI Biotyper 3.1 (BrukerDaltonics, Німеччина). Відповідно до вимог виробника, достовірним вважали видову/родову ідентифікацію мікроорганізмів, при якій рівень збігу отриманого рядуконстантних білків (score) невідомих мікроорганізмів з базою даних перебував у межах 1.7-3.0. При цьому значення 1.70 – 2.29 свідчили про позитивне визначення роду, значення 2.30 – 3.00 – про надійне визначення виду.
Результати та обговорення
У цій роботі, першорядне значення для діагностики утоплення мали ті види мікроорганізмів, які були виявлені і в зразку води з водоймища, з якого було вилучено труп, і аналізованої крові. У ході дослідження у лівому передсерді та стегнової вені з високою точністю (score ≥ 2.2) було виявлено бактерії пологів Aeromonas та Acinetobacter. Ці бактерії не входять до складу нормальної мікрофлори людини (але входять до складу мікробіоти шкіри) і можуть потрапити в кров'яне русло лише за умови аспірації води або шляхом проникнення через рани. У контрольних зразках крові трупів, вилучених у трупів поза водним середовищем, дані бактерії не були виявлені.
Проведені дослідження доводять можливість використання протеомного аналізу із застосуванням приладу MALDI BioTyper для діагностики утоплення. Даний метод є зручним, достовірним та відносно швидким (до 48 годин). Бактерії роду Aeromonas та Acinetobacter можуть розглядатися як маркери для ідентифікації справжнього утоплення.
1. Гололобова М.А. Котов А.А. До питання використання «діатомового тесту» для експертної діагностики утоплення. Теорія та практика судової експертизи 2013; 2: 30: 174-181.
2. Марченко Н.П. Судово-медичне значення виявлення планктону та псевдопланктону у внутрішніх органах при смерті від утоплення / Н.П. Марченка; Матеріали 3-ї розширеної наукової конференції присвяченої пам'яті заслуженого діяча науки проф. М.І. Райського. - Київ, 1958. - С. 52-54.
3. Матишев А.А. Судово-медична експертиза механічної асфіксії/А.А. Матишев, В.І. Вітер. - Л.: Медицина, 1993. - 217 с.
4. Судово-медична служба Республіки Татарстан у 2013 році/уклад: В.А. Спиридонів, Н.В. Морозюк, О.В. Чугунова [та ін.] - Казань: Медицина, 2014. - 128 с.
5. Яблонський М.Ф. Аналіз результатів досліджень на діатомовий планктон при утопленні / М.Ф. Яблонський, В.М. Жовніровський, А.А. Буйнов // Вісник Вітебського Державного медичного університету, 2006. – Вип. 5. - С. 85-88.