Допінг-контроль кількісний аналіз - ФІТНЕС - ЗДОРОВ’Я - СПОРТИВНЕ ХАРЧУВАННЯ - ВІТАМІНИ -
Для багатьох заборонених речовин у спорті для отримання позитивного результату тестів буде достатньо легко отримати їх наявність у сечі. Оскільки більшість методів діагностики та визначення речовин ґрунтуються на використанні хроматографічних аналізів у комбінації з мас-спектрометрією, були створені певні правила для виявлення хімічних речовин за допомогою систем газової та рідинної хроматографії, а також мас-спектрометрії. Наявність речовини підтверджується, якщо відносна представленість певної кількості певних іонів (залежить від використовуваного способу мас-спектрометрії) зразка порівнянна з відповідним стандартним зразком. Крім цього, період утримання речовин не повинен сильно відрізнятися (у діапазоні можливих відхилень) під час проведення хроматографії зразків сечі у спортсменів та контрольних зразків. Отже, для визначення та виявлення речовин у складних для діагностики зразках, особливу роль відіграють результати хроматографії та мас-спектрометрії. На даний момент було проведено велику кількість досліджень результатів мас-спектрометрії із застосуванням стимуляторів та маскуючих засобів, також були створені способи їх виявлення для реалізації антидопінгових тестів.
Анаболічні препарати
Враховуючи статистичну інформацію щодо результатів антидопінгових тестів і класифікацій визначених речовин, що перебувають під забороною, можна відзначити, що найчастіше допінговими засобами, що найбільш використовуються, як і раніше є анаболічні препарати. Наприклад, понад 45% речовин, які перебувають під забороною та виявлені в лабораторіях олімпійського комітету, є анаболічними стероїдами. Цей клас речовин бере активну участь у метаболізмі, формуючи врезультаті підгрупу метаболітів, окислюючи у своїй гидроксогруппы і відновлюючи вуглець-вуглецеві зв'язку. Після цього відбувається зв'язування метаболітів першої фази із сульфатами.
Стандартні правила виявлення метаболітів анаболічних речовин спираються на гідроліз за допомогою ферментів, в результаті якого формуються метаболіти першої фази, потім проводиться очищення, концентрування, отримання похідних, а також подальша діагностика шляхом газової хроматографії та мас-спектрометрії. Більшість метаболітів стероїдних речовин, крім нандролона, не синтезуються організмом людини, тому при ідентифікації цих речовин у сечі, результатом тесту буде позитивний результат.
Дизайнерські стероїди
Основною проблемою використання дизайнерських стероїдів у професійному спорті є їх часткова доступність та легальність. У 2003 році антидопінгова лабораторія Каліфорнійського університету виявила речовину, утворену від гестринону – медикаментозного препарату, що використовується для лікування ендометріозу (розростання клітин ендометрію у жінок). Гідрогенування етинілового залишку, що знаходиться біля 17-ї позиції вуглецю, утворює стероїдний гормон тетрагідрогестринону, що є аналогом сильної анаболічної речовини – тренболону, при цьому випробування на людях з вивченням впливу тетрагідрогестринону на організм не проводилися. Встановлених у лабораторіях методів антидопінгової діагностики явно недостатньо для придушення бажання деяких атлетів перемогти за допомогою обману, ризикуючи при цьому своїм здоров'ям. Якщо врахувати те, що більшість методів діагностики ґрунтуються на зіставленні стандартних проб із зразками сечі з використанням мас-спектрометричних аналізів, наприклад, такого як моніторинг селективних іонів, невизначенілікарські засоби, наприклад, тетрагідрогестринон, будуть не видно для стандартних методів виявлення. Це передбачає необхідність у створенні більш досконалих методів виявлення, що дозволяють визначати всі типи заборонених речовин, у тому числі і не визначених раніше, а також тих речовин, які мають однакову хімічну будову.
Стероїди, вироблені організмом
Якщо під час використання анаболічних препаратів у сечі виявляються метаболіти, які не спостерігаються в нормі, то використання тестостерону як допінгу визначити вже важче, оскільки тестостерон синтезується ендогенним шляхом ендокринними залозами людини. Для вирішення цього завдання проводилася розробка різних методів. Найбільш відомими та широко використовуваними способами є вимірювання балансу тестостерону та епітестостерону, а також мас-спектрометрія з вимірюванням пропорції стійких ізотопів вуглецю. Кількість власних гормонів може коливатися в залежності від ситуації, однак було встановлено, що пропорція тестостерону та епітестостерону є найкращим доказом використання тестостерону як допінгового засобу, оскільки вироблення епітестостерону здійснюється незалежно від статевого гормону тестостерону. Порогом пропорції тестостерону та епітестостерону є коефіцієнт 6, але при збільшенні коефіцієнта позитивний результат фіксується не відразу, надалі спортсмену необхідно також здати аналіз визначення фізіологічно високої концентрації тестостерону.
Висока доступність ізотопної діагностики за допомогою методу мас-спектрального аналізу дозволила провести кілька досліджень, які показали можливість визначення відмінностей ендогенного тестостерону від штучного. Зокрема, було виявлено, щоприродний тестостерон має специфічні відмінності від штучних препаратів тестостерону, які використовуються як медикаментозні засоби. Використання газової хроматографії з подальшим займанням діагностованої речовини і визначенням вуглекислого газу, що при цьому сформувався, допомагає отримувати відомості про походження тестостерону.
Сечогінні засоби і бета2-агоністи
Сечогінні засоби та бета2-агоністи також аналізуються шляхом газової-хроматографії із застосуванням мас-спектрометрії. Клас сечогінних або діуретичних засобів відрізняється великою різноманітністю препаратів, що застосовуються з однією метою – збільшення діурезу. Діуретики найчастіше діагностуються за допомогою негативної іонізації, що пояснюється їх кислотними характеристиками, проте для деякої кількості діуретичних препаратів, наприклад, для тріамтерену, необхідне проведення позитивної іонізації. Для бета2-агоністів головним методом аналізу вважається протопірування речовини, що діагностується, з подальшим визначенням молекули, що має позитивний заряд. Джерела іонів, що пов'язують застосування газової хроматографії та мас-спектроскопії, зазвичай сприяють формуванню протопованих або непротопованих молекул без фрагментації. Отже, загальні відомості про речовини, що діагностуються, селективність і специфічність мас-детекторів визначаються використанням дисоціації, викликаної наголосом молекул іонізованих речовин, і подальшою діагностикою фрагментів. Для цього потрібно мати інформацію про спорідненість речовин з позитивно зарядженими частинками. Для сечогінних препаратів і для більшості бета2-агоністів (крім сальбутамолу) буде достатня реалізація якісного аналізу. Як правило, хроматограми іонів, які зазнали екстракції, надають.можливість проведення високочутливої ідентифікації аналогічних субстанцій в біологічних зразках, позитивний результат аналізу грунтується на кількісному переважанні іонів. У 2001 році близько 17% зафіксованих позитивних результатів тесту на допінг були віднесені до використання бета2-агоністів, діуретичні речовини виявлені в 5% результатів.
Кількісний аналіз
Кількісний аналіз пептидних гормонів
Правила антидопінгового олімпійського комітету свідчать, що наявність великої кількості ендогенних гормонів у крові або їх специфічних маркерів у біологічних рідинах спортсмена є серйозним порушенням, що призводить до дискваліфікації, виняток становить присутність підвищеного рівня гормонів у зв'язку з патологією, що виникла в організмі спортсмена. Однак, у разі використання пептидних гормонів, вираз «високий рівень гормонів» здебільшого стає неправильним. Вироблення більшості пептидних гормонів ендокринними залозами здійснюється систематично, тобто рівні гормонів в організмі залежать від добових біоритмів людини. Крім того, ступінь синтезу гормонів залежить не тільки від статі та віку, але й від впливів навколишнього середовища (температури, тиску і т.д.), стресостійкості, режиму сну та неспання, раціону та інтенсивності фізичних навантажень, у тому числі і кількості тренувальних днів на тиждень\місяць. Активність більшої частини пептидів триває недовго, цей факт також впливає на лабільність рівня гормонів у крові. Відповідно, звичайна ідентифікація гормону в організмі тільки в деяких випадках (ХГЛ у спортсменів-чоловіків) допомагає зробити висновок про вживання гормону спортсменом. Незважаючи на твердження, що нерідко з'являються в пресі,підвищений рівень гормону росту у людини, що не може бути абсолютним підтвердженням застосування спортсменом штучного соматотропіну.
Ще одним чинником проблеми визначення пептидів, є детектування їх аналогів штучного походження, які часто застосовуються як допінг. Синтезовані за допомогою експресії тваринного білка, що кодується ланцюжком людської ДНК, штучні гормони аналогічні за властивостями та будовою природних гормонів. Після введення гормонів у кров визначити штучність кожної молекули гормону практично неможливо.
Крім того, негативні фактори, що стосуються розробки допінг-тестів на наявність пептидів, визначаються методологічними відмінностями щодо стероїдів та пептидів. Стероїди протягом кількох років ідентифікуються в крові за допомогою методів газової хроматографії та мас-спектрометричного аналізу, за рахунок цих способів діагностики у співробітників спеціалізованих лабораторій олімпійського комітету формується новий досвід. У більшості випадків газова хроматографія та мас-спектрометрія вважається еталоном при ідентифікації гормонів. Однак, дані способи визначення ніколи не використовувалися для діагностики пептидів, і на сьогоднішній момент ще не створено основних постулатів для реалізації їх допінг-перевірки.
Висновок
Під час проведення антидопінгових перевірок оцінка низькомолекулярних структур обумовлена переважно використанням газової або рідинної хроматографії та методів мас-спектрометрії, завдяки яким можливе визначення допінгових речовин у біологічних рідинах (у крові, у сечі). Тоді як раніше діагностика проводилася в основному із застосуванням методів газової хроматографії з визначенням розділених речовин різними детекторами (ПІД, АФД та мас-спектрометрія), то останнім часом використовується як правило метод рідинної хроматографії, елементи поділу якої через деякий час після іонізації під тиском проходять мас-спектрометрію, оскільки саме цей спосіб аналізу допомагає значно зменшити час очищення проб крові або сечі і не потребує дериватизації діагностованих речовин. Крім цього, за рахунок використання іонних пасток та квадрупольних аналізаторів ставати можлива реалізація найрізноманітніших експериментів із застосуванням мас-спектрометрії, зосереджених на ідентифікації популярних медикаментозних засобів, а також невизначених речовин, що дозволяє посилити антидопінгову боротьбу. З часів розробки переліку заборонених речовин і методик стимуляції охоплення речовин, які знаходяться під спостереженням антидопінгових федерацій, практично не змінюється, тому діагностичним лабораторіям через постійно змінний діапазон допінгових препаратів необхідно регулярно розвивати і переглядати методи діагностики, збільшуючи їх показники чутливості обмеження вживання медикаментозних засобів у професійних спортсменів, щоб уникнути помилкових припущень про їх репутацію. В даному випадку новітні технології в галузі хроматографічної діагностики та мас-спектрометрії з високою чутливістю, а також нових способом іонізації дають діагностичним лабораторіям важливі інструменти, що дозволяють отримати ще більш розширені відомості про речовини, наприклад, про їх будову, фармакокінетичні та фармакодинамічні властивості а також збільшити діапазон часу виявлення тривалості використання стимуляторів та інших заборонених субстанцій. Так як більшість препаратів, наприклад, анаболічні стероїди, використовуються впередзмагальний період і при цьому не втрачають своєї ефективності протягом декількох тижнів, то для проведення повної антидопінгової перевірки в цьому випадку слідує здача аналізів як у період змагання, так і в передзмагання. Крім цього, для реалізації цієї перевірки необхідна високочутлива та специфічна діагностика.