Дослідження хромосом методом FISH
FISH – один із найдивовижніших «інструментів» молекулярної біології XXI століття. У преимплантационной діагностиці дослідницька техніка FISH застосовується виявлення хромосомних аномалій чи порушень парності хромосом у клітинах ембріона, щойно отриманого методом екстракорпорального запліднення (ЭКО). Якщо аномалій або ознак анеуплоїдії (порушення парності, нестачі хромосомних пар) не виявлено, то «штучний» ембріон визнається життєздатним. Його можна імплантувати у матку майбутньої матері.
FISH дозволяє також простежити статеві ознаки набору хромосом ембріона. Це дає можливість визначити стать майбутньої дитини ще до фактичного настання вагітності (якщо вважати її початком імплантацію позатілесно зачатого ембріона в матку).
Що таке FISH?
Абревіатура розшифровується так: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, або флюоресцентна гібридизація in-situ. Розшифровка, швидше за все, нічого не каже необізнаному читачеві. Тому розберемо складне поняття частинами, залишивши недоперекладене «in-situ» наостанок.
Гібридизація
У молекулярної біології цього терміна цілком особливе значення, має нічого спільного зі схрещуванням видів у «звичайній» біології.
Гібридизація – це молекулярно-генетичний прийом, що застосовується для оцінки стану ДНК та РНК досліджуваних клітин. Він заснований на поєднанні окремих ланцюжків нуклеїнових кислот у єдину молекулу. Таким чином, перевіряється комплементарність (взаємна відповідність) молекул або їх фрагментів один одному. При повній комплементарності ланцюжки легко і швидко поєднуються у загальну молекулу. Повільне об'єднання говорить про недостатню комплементарність. Некомплементарність ланцюжків таки обумовлена хромосомними аномаліями (порушеннямипорядку розташування хромосом на тих чи інших ділянках), непарністю хромосом або відсутністю деяких пар.
«Інструментом» для вимірювання комплементарності є температура, коли ланцюжки ДНК гібридизуються в загальну молекулу. Для цього потрібно спочатку нагріти препарат нуклеїнової кислоти, а потім змішати його з іншим нагрітим препаратом, охолодити. При нагріванні водневі зв'язки між ланцюжками ДНК або РНК зникають, утворюються одноланцюгові фрагменти молекул. Змішані препарати двох ДНК чи РНК (або ДНК – РНК) охолоджуються. При охолодженні водневі зв'язки між комплементарними основами швидко відновлюються, утворюється єдина гібридна молекула ДНК (РНК або ДНК – РНК). При нестачі комплементарності процес довше, некомплементарні фрагменти залишаються неприєднаними. Отже, чим вища температура гібридизації, тим гармонійнішими і правильнішими є хромосомні будови клітин. Чим нижча температура, тим більше аномалій у хромосомах. На основі аналізу некомплементарних залишків можна встановити конкретні аномалії чи ділянки анеуплоїдії.
Флюоресцентне маркування
Для аналізу комплементарності гібридизуючої молекули ДНК (або РНК) застосовуються особливі генетичні зонди (або ДНК-зонди), які, звичайно ж, теж мають мало спільного зі своїми «тезками», що використовуються, наприклад, у хірургії.
Генетичні зонди це синтезовані та спеціально помічені одноланцюгові ДНК (рідше РНК) із заздалегідь встановленими властивостями комплементарності. При гібридизації вони зливаються з певними генетичними фрагментами, таким чином підтверджуючи їх комплементарність. Розташування зондів у гібридизованій молекулі свідчить про нормальну або дефектну будову первісного хромосомного матеріалу, з якого зібрано це"Штучне спорудження".
Генетичні зонди позначають, зокрема, речовинами, що світяться (флюоресціюють), що робить їх помітними під об'єктивом спеціального флюоресцентного мікроскопа.
Застосування різних барвників для кількох зондів дозволяє проводити одночасний аналіз різних генетичних структур, наприклад, виявляти ділянки хромосом із двома накладеними один на одного генами та інші аномалії.
В даний час при проведенні єдиного аналізу генетичні зонди мітять п'ятьма-шістьма різними барвниками, іноді навіть сім'ю.
In-situ означає «у себе вдома»
Початкова техніка гібридизації була громіздкою. Вилучені ДНК денатурувалися в спеціальних термобуферах, змішувалися в центрифузі коїться з іншими денатурованими фрагментами. Гібридизація також проводилася лабораторно, "в хімічному посуді".
Сучасна техніка дозволяє проводити аналізи in-situ, тобто "на місці", "у себе вдома", у початкових генетичних структурах, а не в лабораторно виготовлених препаратах. Об'єктами дослідження стали самі ядра клітин (отриманих при біопсії полярних тілець, бластомерів, поверхневих клітин бластоцисти).
Спостереження за генетичним матеріалом прямо в ядрах клітин прискорює процес, робить його «чистішим», вільнішим від зовнішніх впливів та пошкоджень, які не виключені при виготовленні лабораторних препаратів.
Існують, однак, і проблеми, що вказують на непереборні межі цього методу. Єдиною гібридизацією неможливо "охопити" весь набір хромосом у клітинах. Необхідно зазвичай дві-три послідовні гібридизації, що дозволяють досліджувати 12-15 хромосомних пар (а їх у людини 23). Здатність до подальшої гібридизації у ланцюжків ДНК після кожної їхньої регібридизації поступово знижується.Це не дозволяє проводити гібридизацію «скільки завгодно разів» для вичерпного аналізу одного й того ж генетичного матеріалу.