Ферменти рестрикції
Проривом у розробцімолекулярного клонуваннястало відкриття на початку 1970-х років бактеріальних ендонуклеаз (рестриктаз) — ферментів, які розпізнають специфічні послідовності у подвійній спіралі ДНК та розщеплюють обидві нитки ДНК у місці (сайті) розпізнавання. Розриви можуть бути прямо протилежні один до одного, в цьому випадку вони залишають закінчені нитки ДНК, або можуть бути зміщені на кілька пар основ у будь-якому напрямку, що призводить до того, що один з кінців нитки ДНК нависає над іншим.
В даний час відомо більше 3500 ферментів рестрикції, кожен зі своїм власним сайтом розпізнавання, що складається з чотирьох або шести пар основ, хоча кілька ферментів мають більш довгі сайти. Послідовність основ сайту зазвичай буває паліндромом, тобто. збігається під час читання як з 5', і з 3'-кінця нитки ДНК.
Наприклад,ферментрестрикції ЕсоRI розпізнає специфічну паліндромну послідовність з шести пар основ 5'-GAATTC-3, де б вони не знаходилися в подвійній молекулі ДНК.
Фермент розщеплює ДНКу цьому місці, зі зміщенням розривів у нитках ДНК у 4 пари основ між гуаніном та суміжним аденіном у послідовності GAATTC. При цьому утворюється два фрагменти, кожен з однонитковим закінченням з чотирьох основ 5'-ААТТ-3' в кінці.
Розщеплення молекули ДНК конкретним ферментом рестрикції розриває ДНК на характерний і відтворюваний набір фрагментів, розподіл довжин яких відображає частоту і позиції специфічних місць впливу ферменту. Наприклад, рестриктаза ЕсоRI розриває подвійну спіраль ДНК специфічно в послідовності 5'-GAATTC-3'.
ОбробкаДНКвсього геному людини ферментом ЕсоRI генерує набір приблизно з 1 млнфрагментів змінної довжини, кожен із конкретною позицією в геномі. У середньому фермент із сайтом розпізнавання в 6 пар основ, подібно до ЕсоRI, повинен розщеплювати ДНК людини через кожні 46 пар основ, або кожні 4096 пар основ. Насправді такі місця не розподілені рівномірно через склад основ та його послідовності протягом геному.
Таким чином,ЕсоRIфрагментує ДНК на шматки розміром від десятка до багатьох сотень тисяч пар основ; довжина кожного фрагмента визначається тим, скільки ДНК знаходиться між двома послідовними сайтами розпізнавання ЕсоRI.
Оскільки всі молекулиДНК, оброблені ферментом ЕсоRI, незалежно від їх походження, мають ідентичні однониткові кінці, будь-які дві ДНК молекули, оброблені ЕсоRI, можуть бути з'єднані разом in vitro, шляхом парування комплементарних кінців, що містять 4 пари основ, за допомогою ферменту ДНК-лігази. Це створює рекомбінантну молекулу ДНК, один кінець якої походить з одного джерела, а другий від іншого.
Коли фермент рестрикції розрізає обидві нитки в одній і тій же позиції, залишаючи «тупі» кінці, ДНК-лігаза також може з'єднувати їх разом без необхідності в сумісності ниток, що «нависають».