Флуоресценція хлорофілу
Флуоресценція хлорофілу- явище світіння хлорофілу при поглинанні ним світла, відбувається в результаті повернення молекули зі збудженого в основний стан. Широко використовується як показник фотосинтетичного перетворення енергії у вищих рослин, водоростей та бактерій. Збуджений хлорофіл втрачає поглинену світлову енергію, витрачаючи її на фотосинтез (фотохімічні перетворення енергії або фотохімічне гасіння), переводячи її в тепло в результаті нефотохімічного гасіння або випромінюючи у вигляді флуоресценції. Оскільки всі ці процеси конкурують один з одним, аналізуючи флуоресценцію хлорофілу, можна отримати уявлення про інтенсивність фотосинтезу та здоров'я рослини [1] .
Зміст
Після освітлення адаптованого до темряви листя, можна спостерігати швидке зростання флуоресценції Фотосистеми II (ФС II), за яким слідує повільний спад. Вперше цей феномен описали Х. Каутський та А. Хірш у 1931 році. На ім'я свого першовідкривача ефект був названий Каутським ефектом.
Збільшення флуоресценції відбувається через те, що реакційні центри фотосистеми II (ФСІІ) переходять у «закритий» стан. Реакційний центр називається "закритим", коли він більше не в змозі передавати електрони. Це відбувається, коли переносник електронів відновлений і ще не передав свої електрони наступному акцептору електронів. Закриття реакційних центрів знижує загальну ефективність фотохімічних реакцій (kP), тому підвищує рівень флуоресценції (kF). Різке перенесення листа з темнового стану світ збільшує частку закритих реакційних центрів ФСII і призводить до посилення флуоресценції протягом перших 1-2 секунд. Пізніше флуоресценція повільно слабшає, цей процес може тривати кілька хвилин.Падіння зумовлене активацією «фотохімічного гасіння» та перенесення електронів від ФСII по ЕТЦ хлоропластів до НАДФ та циклу фіксації вуглецю, а також включенням механізмів нефотохімічного гасіння, що перетворює енергію збудження на тепло.
Щоб використати вимірювання флуоресценції хлорофілу для аналізу фотосинтезу, дослідники повинні розрізняти фотохімічне гасіння та нефотохімічне гасіння (тепловиділення). Це досягається шляхом зупинки фотохімічних реакцій, що дозволяє дослідникам виміряти флуоресценцію в присутності нефотохімічного гасіння. Для цього рослину різко висвітлюють сильним спалахом світла або виносять на світло після темнової адаптації. Відбувається тимчасове закриття всіх реакційних центрів ФСII, і енергія не передається ланцюгом переносників електронів. Нефотохімічне гасіння не впливає, якщо спалах досить короткий. Під час спалаху (або після різкого винесення рослини на світло з темряви) відбувається насичення реакційних центрів світлом із переходом у закритий стан. У таких умовах, коли відсутнє будь-яке фотохімічне гасіння, а не фотохімічне гасіння зневажливо мало, флуоресценції досягає свого максимального рівня, що позначається як максимум флуоресценції F m > [2] .
Загальні параметри флуоресценції
F t r > : Термінальна флуоресценція (у відносних одиницях) Гасіння флуоресценції станом на кінець тесту.
Розрахункові параметри
Φ P S I I > : Ефективність фотохімічних реакцій фотосистеми ІІ Розраховується як Y (I I) > = F m ′ − F F m ′ >'-F>>'>>> [6] . Цей параметр показує частку світла, поглиненого ФСІІ, яке використовувалося у фотохімічних реакціях. Як такий, він може дати вимірювання швидкості лінійноготранспортує електрони і тому характеризує весь фотосинтез в цілому.
Ефективність фотосистеми II як міра фотосинтезу
Флуоресценція хлорофілу використовується для вимірювання рівня фотосинтезу, але по суті це надмірне спрощення. По флуоресценції можна виміряти ефективність фотохімії ФСII, яку можна використовуватиме оцінки швидкості лінійного транспорту електронів шляхом множення інтенсивність світла. Однак, коли дослідники говорять "фотосинтез", вони зазвичай мають на увазі фіксацію вуглецю. Транспорт електронів і фіксація CО2 мають досить хорошу кореляцію, але її може не спостерігатися в польових умовах через такі конкуруючі процеси як фотодихання, азотистий обмін і реакція Мелера.
Зв'язок транспорту електронів з фіксацією вуглекислого газу
Для одночасного вимірювання флуоресценції хлорофілу та газообміну, щоб отримати повну картину реакції рослин на їхнє оточення, необхідна серйозна та складна дослідницька техніка. Один з методів полягає в одночасному вимірі фіксації СО2 і фотохімічних реакцій ФСII при різній інтенсивності світла, в умовах пригнічення фотодихання. Графіки фіксації СО2 та фотохімічних реакцій ФСII дозволяють обчислити кількість електронів, необхідні асиміляції однієї молекули СО2. Виходячи з цієї оцінки можна оцінити рівень фотодихання. Цей метод використовується для дослідження значущості фотодихання як фотозахисний механізм під час посухи.
Вимірювання рівня стресу та стресостійкості
Флуоресценція хлорофілу дозволяє виміряти рівень стресу рослин. За її рівнем можна судити про рівень впливу абіотичних стресів, оскільки екстремальні температури, надмірне висвітлення та посуха негативно впливають на метаболізм рослин. Це у своючерга призводить до дисбалансу між поглинанням світлової енергії хлорофілом та використанням цієї енергії в процесі фотосинтезу [8] .
Індекс азотистого балансу
Виявилося, що можна судити про азотистий метаболізм рослин за рівнем поліфенолів. Коли рослина знаходиться в оптимальних умовах, це сприяє нормальному обміну речовин і синтезу білків (основна форма біологічного азоту), хлорофілів та невеликої кількості флавоноїдів (вторинні метаболіти). З іншого боку, у разі нестачі азоту, спостерігається підвищений виробіток флавоноїдів [10] .
Вимірювання вмісту хлорофілу
Розвиток флуориметрів зробив вимірювання флуоресценції хлорофілу простим способом у фізіології рослин. Революцію в аналізі флуоресценції хлорофілу справило винахід методики пульс-амплітудної модуляції (англ. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM)) [12] [13] та поява першого комерційного імпульсного флуориметра або ПАМ-флуориметра PAM-10. Шляхом модуляції амплітуди вимірювального світлового пучка (мікросекундний діапазон імпульсів) і паралельного виявлення флуоресценції, що збуджується, можна визначити відносний вихід флуоресценції (Ft) в присутності розсіяного світла. Принципово це означає, що флуоресценція хлорофілу можна вимірювати в польових умовах навіть під прямими променями сонця [2] .
Деякі імпульсні флуориметри можуть визначити як світлові параметри, так і темнова адаптація параметрів (Fo, Fm, Fo', Fm', Fv/Fm, Y, Ft, Foq) і можуть розрахувати коефіцієнти гасіння фотохімічного і нефотохімічного гасіння (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) та NPQ). Деякі флуориметри повністю портативні та керується однією рукою.
Розвиток системи візуалізації полегшив визначення просторовихнеоднорідностей фотосинтетично активних зразків. Ці неоднорідності виникають у листі рослин, наприклад, через нарости, різні екологічні стреси або збудники інфекції. Знання про неоднорідність зразка має важливе значення для правильної інтерпретації результатів вимірювання фотосинтетичної продуктивності зразка. Високі показники якості зображення забезпечують можливість аналізу однієї клітини або навіть одного хлоропласту, а також площ, що охоплюють ціле листя або рослини.
LIF-сенсори
Методи, засновані на ефекті Каутського, не вичерпують всього різноманіття методів вимірювання флуоресценції хлорофілу. Зокрема, останні досягнення в галузі лазер-індукованої флуоресценції (LIF) надають можливість розробки досить компактних і ефективних сенсорів для визначення фотофізіологічного статусу та оцінки біомаси. Замість вимірювання загального потоку флуоресценції, такі датчики реєструють оптичну щільність цього потоку, збудженого сильним лазерними імпульсами наносекундної тривалості. Такий метод не вимагає 15 - 20 хв темнової адаптації (як у випадку з методами, заснованими на ефекті Каутського [14] ) і дає можливість порушувати зразок зі значної відстані. LIF-сенсори можуть забезпечити швидку та оцінку з досить великої відстані.