Генна терапія трансгенними клітинами
Терапію трансгенними клітинами з цільовою генно-інженерною конструкцією можна назвати комбінованою. Для її здійснення необхідно ввести цільовий ген у клітину. Така комбінація поєднує властивості клітинного вектора, генної функції та ефект клітинної терапії.
Трансгеноз (перенесення генетичного матеріалу) in vitro спрямовано соматичні клітини-мішені, заздалегідь виділені з організму (наприклад, резецированная печінка, культура лімфоцитів чи фібробластів, кістковий мозок, пухлинні клітини). Для введення ДНК у клітини ссавців використано багато підходів: хімічні (мікропреципітати фосфату кальцію, DEAE-декстран, диметилсульфоксид), злиття клітин (мікроклітини, протопласти), фізичні (мікроін'єкції, електропорація, лазерна мікроін'єкція) та вірусні (ретровіруси) . Невірусні методи, за винятком електропорації та лазерної мікроін'єкції, малоефективні. Найбільш ефективні переносники ДНК у клітини – «природні шприци» – віруси.
Процедура трансгенозу клітин має закінчуватися перевіркою її успішності. Трансгеноз можна вважати успішним, якщо не менше 5% всіх оброблених клітин матиме введений генетичний матеріал.
Кінцева процедура генної терапії через трансгеноз соматичних клітин in vitro – реімплантація трансгенних клітин-мішеней. Вона може бути органотропною (печінкові клітини вводять через ворітну вену) або ектопічною (клітини кісткового мозку вводять через периферичну вену).
Клітинно-генна терапія була прийнята у клінічній практиці швидше, ніж можна було очікувати. Варіанти її застосування можна показати з прикладу трьох хвороб.
Недостатність аденозиндезаміназ. Лімфоцити хворої дівчинки у віці 4 років (США), що страждає на первинний імунодефіцит,обумовленим мутацією в гені аденозиндезаміназ, були заздалегідь відокремлені від інших елементів крові, а Т-лімфоцити стимульовані до зростання. Потім in vitro за допомогою ретровірусного вектора в них було введено ген аденозиндезамінази. Приготовлені таким чином генно-інженерні лімфоцити повернули в кровотік.
З протоколу клінічного випробування стало ясно, що, по-перше, лімфоцити пацієнтів з тяжким імунодефіцитним станом можуть бути ізольовані та вирощені у лабораторних умовах. У них можна ввести ген та повернути в кровотік хворого. По-друге, лікування хворого було ефективним. Загальна кількість лімфоцитів збільшилася до нормального показника, а активність аденозиндезаміназ в Т-лімфоцитах збільшилася до 25% норми. Зі стерильного боксу дівчинку перевезли додому. По-третє, протягом 6 місяців перед черговим курсом лікування кількість генноінженерних лімфоцитів та активність ферменту в клітинах залишалися постійними.
Вибір хвороби початку використання генотерапії був добре продуманий. Ген аденозиндезаміназ до цього часу був клонований, мав середні розміри і добре вбудовувався в ретровірусні вектори. Раніше під час трансплантації кісткового мозку при недостатності аденозиндезамінази було показано, що ключову роль у розвитку захворювання відіграють Т-лімфоцити. Отже, генотерапія має бути спрямована на ці клітини-мішені. Важливим моментом стало те, що функціонування імунної системи можливе за активності ферменту, що становить 5-10% контрольного показника. Нарешті, генно-інженерні Т-лімфоцити мали селективну перевагу перед вихідними дефектними клітинами. В даний час близько 50% дітей з недостатністю аденозиндезамінази лікують за допомогою генотерапії.
Сімейна гіперхолестеринемія. Рецептори ЛПНГ, що грають ключовуроль обміну холестерину, синтезуються у клітинах печінки. У зв'язку з цим генотерапія має бути спрямована на гепатоцити (клітини-мішені). Спробу такого лікування було здійснено у США щодо жінки віком 29 років з різко вираженим атеросклерозом вінцевих артерій. Ефект попереднього хірургічного шунтування вже минув. Брат хворий помер від того самого захворювання, не доживши до віку 30 років.
Генотерапія була проведена у кілька етапів. Хворий було зроблено часткову (близько 15%) гепатектомію. Віддалену частку печінки промили розчином колагенази для поділу гепатоцитів, при цьому отримано близько 6 млн клітин. Їх вирощували у 800 культуральних чашках на живильному середовищі. Під час зростання в культурі для включення нормального гена ЛПНЩ у клітини використовували вектор ретровірусу. Для того, щоб клітини досягли печінки, трансгенні гепатоцити були зібрані та введені пацієнтці через катетер у ворітну вену. Через кілька місяців при біопсії печінки виявили, що у деяких клітинах функціонує новий ген. Вміст ЛПНГ у крові знизився на 15-30%. Поліпшення стану хворої дозволило проводити лікування лише лікарськими засобами, що знижують концентрацію холестерину.
Гемофілія А. Опубліковано результати лікування шести пацієнтів із гемофілією. Від кожного хворого була отримана та вирощена культура шкірних фібробластів, яку потім трансфікували плазмідою, що містить послідовність гена, що кодує фактор VIII. Клітини, які його продукують, були відібрані, клоновані, розмножені і шляхом лапароскопічної ін'єкції введені в сальник. Жодних ускладнень у пацієнтів не зареєстровано. У чотирьох хворих протягом 10 місяців концентрація фактора VIII була вищою, ніж до лікування, а хороший стан підтримували при екзогенному.запровадження зменшеної дози фактора. В експериментальних роботах показано можливість корекції вмісту фактора VIII після трансплантації аутологічних гематопоетичних клітин, трансфікованих генетичною конструкцією з нуклеотидною послідовністю гена фактора VIII.
Рак. Надзвичайно швидкий прогрес у вивченні геному людини та методів генної інженерії дозволяє розвивати генну терапію не тільки для моногенно успадкованих хвороб, але і для таких багатофакторних захворювань, як рак. Генна терапія злоякісних новоутворень вже розпочато, хоча на її шляху багато труднощів, зумовлених необхідністю забезпечення селективності, специфічності, чутливості та безпеки перенесення генів.
В даний час застосовують наступну стратегію генотерапії раку:
Незважаючи на перспективність різних варіантів генотерапії пухлинних захворювань і підбадьорливі експериментальні дані, результати клінічних досліджень дуже суперечливі і яких-небудь помітних ефектів не отримано. Можливо, це зумовлено початком лікування раку на дуже занедбаних стадіях. Як відомо, істотних досягнень під час лікування злоякісних новоутворень іншими біологічними методами також немає. Виняток становлять меланоми (імунобіологічний підхід) та гліобластома (генна терапія). Генотерапія раку - величезний розділ сучасної медицини, але прогнозувати його дуже важко.
Область генотерапії раку переживає стадію «незграбного підлітка». Цей напрямок ще не досяг зрілості і, ймовірно, має великий потенціал. У Китаї вже офіційно дозволені до застосування два генотерапевтичні препарати для лікування важких форм раку шиї та голови (гендицин і Н101).