Генна терапія, Журнал Популярна Механіка
Міодистрофія Дюшенна - одне з нечасто зустрічаються, але все ж таки щодо поширених генетичних захворювань. Хвороба діагностується в трьох-п'ятирічному віці, зазвичай у хлопчиків, виявляючись спочатку лише в утруднених рухах, до десяти років страждає на таку міодистрофію вже не може ходити, до 20-22 років його життя закінчується. Вона викликана мутацією гена дистрофіну, що знаходиться у Х-хромосомі. Він кодує білок, що з'єднує мембрану м'язової клітини зі скоротливими волокнами. Функціонально це своєрідна пружина, що забезпечує плавне скорочення та цілісність клітинної мембрани. Мутації в гені призводять до дистрофії скелетних м'язових тканин, діафрагми та серця. Лікування захворювання носить паліативний характер і дозволяє лише трохи полегшити страждання. Проте з розвитком генної інженерії з'явилося світло наприкінці тунелю.
Про війну та мир
Генна терапія - це доставка клітини конструкцій на основі нуклеїнових кислот для лікування генетичних захворювань. За допомогою такої терапії можна виправити генетичну проблему на рівні ДНК та РНК, змінюючи процес експресії потрібного білка. Наприклад, клітину можна доставити ДНК з виправленою послідовністю, з якою синтезується функціональний білок. Або, навпаки, можливе видалення певних генетичних послідовностей, що також допоможе зменшити шкідливі наслідки мутації. У теорії це просто, проте на практиці генна терапія базується на найскладніших технологіях роботи з об'єктами мікросвіту і є сукупністю передових ноу-хау в галузі молекулярної біології.
«Ген дистрофіну, мутації якого породжують міодистрофію Дюшенна, величезний, — розповідає директор розвитку біотехнологічної компанії «Марлін Біотех», кандидат біологічних наук Вадим Жерновков. — Він включає 2,5 млн пар нуклеотидів, що можна було б порівняти з кількістю літер у романі «Війна і мир». І ось уявімо, що ми вирвали з епопеї кілька якихось важливих сторінок. Якщо на цих сторінках описуються суттєві події, то розуміння книги було б утруднене. Але з геном дедалі складніше. Знайти іншу копію «Війни та миру» нескладно, і тоді сторінки, які бракують, можна було б прочитати. Але ген дистрофіну знаходиться у X-хромосомі, а у чоловіків вона одна. Таким чином, у статевих хромосомах у хлопчиків при народженні зберігається лише одна копія гена. Іншу взяти нема де.
Нарешті, при синтезі білка з РНК важливим є збереження рамки зчитування. Рамка зчитування визначає, яка група трьох нуклеотидів зчитується як кодон, що відповідає одній амінокислоті в білку. Якщо відбулося видалення в гені фрагмента ДНК, не кратне трьом нуклеотидам, відбувається зсув рамки зчитування кодування змінюється. Це можна було б порівняти з ситуацією, коли після вирваних сторінок у всій книзі всі літери заміняться на наступні за алфавітом. Вийде абракадабра. Ось те саме відбувається з неправильно синтезованим білком».
Чи зможе людина дожити до 1000 років: регенеративна медицина
Біомолекулярний пластир
Один із ефективних методів генної терапії для відновлення нормального синтезу білка – пропуск екзонів за допомогою коротких нуклеотидних послідовностей. У «Марлін Біотех» вжевідпрацьовано технологію роботи з геном дистрофіну за допомогою такого методу. Як відомо, у процесі транскрипції (синтезу РНК) спочатку формується так звана прематрична РНК, що містить як діючі ділянки (екзони), що кодують білок, так і некодуючі (інтрони). Далі починається процес сплайсингу, в ході якого інтрони та екзони роз'єднуються та формується «зріла» РНК, що складається тільки з екзонів. У цей момент деякі екзони можна заблокувати, заліпити за допомогою особливих молекул. У результаті в зрілій РНК не виявиться тих кодуючих ділянок, яких ми воліли б позбутися, і таким чином відновиться рамка зчитування, білок синтезуватиметься.
«Цю технологію ми налагодили in vitro, — розповідає Вадим Жерновков, тобто на клітинних культурах, вирощених із клітин пацієнтів із міодистрофією Дюшенна. Але окремі клітини – це не організм. Вторгаючись у процеси клітини, ми повинні спостерігати наслідки наживо, проте залучити до випробувань людей неможливо з різних причин — від етичних до організаційних. Тому виникла потреба одержання моделі міодистрофії Дюшенна з певними мутаціями на основі лабораторної тварини».
Як вколоти мікросвіт
Трансгенні тварини - це отримані в лабораторії тварини, геном яких цілеспрямовано, усвідомлено внесені зміни. Ще в 70-х роках минулого століття стало зрозуміло, що створення трансгенів - це найважливіший метод дослідження функцій генів і білків. Одним з ранніх методів отримання повністю генно-модифікованого організму стала ін'єкція ДНК в пронуклеус («попередник ядра») зигот запліднених яйцеклітин. Це логічно, тому що модифікувати геном тварини найпростіше на самому початку її розвитку.
Ін'єкція в ядро зиготи — вельми нетривіальна процедура, адже йдеться про мікромасштаби. Яйцеклітина миші має діаметр 100 мкм, а пронуклеус – 20 мкм. Операція відбувається під мікроскопом з 400-кратним збільшенням, проте ін'єкція - це сама що не є ручна робота. Зрозуміло, для «уколу» застосовується не традиційний шприц, а спеціальна голка з порожнистим каналом усередині, куди набирається генний матеріал. Один її кінець можна тримати в руці, а інший - надтонкий і гострий - практично не видно неозброєним оком. Звичайно, така тендітна конструкція з боросилікатного скла не може зберігатися довго, тому в розпорядженні лабораторії є набір заготовок, які безпосередньо перед роботою витягуються на спеціальному верстаті. Використовується спеціальна система контрастної візуалізації клітини без фарбування — втручання у пронуклеус саме собою травматично і є чинником ризику для виживання клітини. Фарба стала б ще одним таким чинником. На щастя, яйцеклітини досить живучі, проте кількість зигот, які дають початок трансгенним тваринам, становлять лише кілька відсотків від загальної кількості яйцеклітин, в які було зроблено ін'єкцію ДНК.
Наступний етап – хірургічний. Проводиться операція з трансплантації мікроін'єцованих зигот у вирву яйцеводи миші-реципієнта, яка стане сурогатною матір'ю майбутнім трансгенам. Далі лабораторна тварина природним шляхом проходить цикл вагітності, і світ з'являється потомство. Зазвичай у посліді знаходиться близько 20% трансгенних мишенят, що також говорить про недосконалість методу, бо в ньомує великий елемент випадковості. При ін'єкції дослідник неспроможна контролювати, як саме впроваджені фрагменти ДНК вбудуються геном майбутнього організму. Висока ймовірність таких комбінацій, які призведуть до загибелі тварини ще на ембріональній стадії. Проте метод працює і цілком придатний низки наукових цілей.
Ножиці для ДНК
Але є ефективніший спосіб на основі цільового редагування геному за технологією CRISPR/Cas9. «Сьогодні молекулярна біологія в чомусь подібна до епохи далеких морських експедицій під вітрилами, — каже Вадим Жерновков. — Майже щороку в цій науці відбуваються значні відкриття, які можуть змінити наше життя. Наприклад, кілька років тому мікробіологи виявили у давно здавалося б вивченого виду бактерій імунітет до вірусних інфекцій. В результаті подальших досліджень з'ясувалося, що ДНК бактерій містять особливі локуси (CRISPR), з яких синтезуються фрагменти РНК, які вміють комплементарно зв'язуватися з нуклеїновими кислотами чужорідних елементів, наприклад з ДНК або РНК вірусів. З такою РНК зв'язується білок Cas9, що є фермент-нуклеазою. РНК служить для Cas9 гідом, що позначає певну ділянку ДНК, в якому нуклеаза робить розріз. Приблизно три-п'ять років тому з'явилися перші наукові праці, в яких розроблялася технологія CRISPR/Cas9 для редагування геному».
Порівняно зі способом введення конструкції для випадкового вбудовування, новий метод дозволяє підібрати елементи системи CRISPR/Cas9 таким чином, щоб точно націлити РНК-гіди на потрібні ділянки геному і досягти цілеспрямованої делеції або вставки потрібної послідовності ДНК. У цьому методі також можливі помилки (РНК-гід іноді з'єднується не з тією ділянкою, на яку його націлюють), проте при використанні CRISPR/Cas9 ефективність створення трансгенів становить близько 80%. «Цей метод має широкі перспективи, і не тільки для створення трансгенів, а й в інших областях, зокрема генної терапії, — каже Вадим Жерновков. — Проте технологія перебуває лише на початку шляху, і уявити, що найближчим часом виправляти генний код людей за допомогою CRISPR/Cas9 досить складно. Поки є ймовірність помилки, є й небезпека, що людина втратить якусь важливу частину геному, що кодує».
Молоко-ліки
українській компанії «Марлін Біотех» вдалося створити трансгенну мишу, в якій повністю відтворено мутацію, що призводить до міодистрофії Дюшенна, і наступним етапом стануть випробування технологій генної терапії. Натомість створення моделей генетичних захворювань людини на основі лабораторних тварин — не єдине можливе застосування трансгенів. Так, в Україні та західних лабораторіях ведуться роботи в галузі біотехнологій, що дозволяють отримувати важливі для фарміндустрії лікарські білки тваринного походження. Як продуценти можуть виступати корови або кози, у яких можна змінювати клітинний апарат виробництва білків, що містяться в молоці. З молока можна екстрагувати лікарський білок, отриманий не хімічним способом, а з допомогою природногомеханізму, що підвищить ефективність ліків В даний час розроблено технології отримання таких лікарських білків, як лактоферин людини, проурокіназа, лізоцим, атрін, антитромбін та інші.