Хімічний каталог Практикум з біохімії стор 85
ралеподібні утворення – нуклеїнові кислоти. Для повнішого осадження розчин переливають зі склянки в склянку. Спіралеподібні нитки обережно переносять паличкою в склянку з невеликою кількістю 70% етилового спирту, повторюючи операцію 2-3 рази з новими порціями спирту. Потім нуклеїнові кислоти промивають спочатку сумішшю спирт-ефір (1:1), потім ефіром і залишають сушитися при кімнатній температурі.
Поділ ДНК і РНК- Сухий препарат нуклеїнових кислот розчиняють у 0,5 н. NaOH з розрахунку 2-3 мг/мл і витримують 15 хв у киплячій водяній бані. Розчин охолоджують і нейтралізують на холоді, додаючи краплями при помішуванні концентровану НСЮ4, потім доводять концентрацію НСЮ4 до 2%. Осад, що випав, ДНК відокремлюють на центрифузі з охолодженням (3000 g, 10 хв). Осад промивають двічі холодним розчином 2%-ної НС104 і двічі 70%-ним спиртом, потім сумішшю спирт-ефір і ефіром (осад щоразу збирають центрифугуванням). Осад ДНК висушують на повітрі та аналізують.
2. ВИДІЛЕННЯ ПРЕПАРАТІВ ДНК І РНК ФЕНОЛЬНИМ МЕТОДОМ (ПО КИРБІ-ГЕОРГІЄВУ)
27 Тут і в інших завданнях при виділенні ДНК із печінки тварина рекомендується не годувати протягом доби.
Метод передбачає отримання високополімерних ДНК та РНК, вільних від білків. Під дією водонасиченого фенолу на ну-клеопротеїди здійснюється їх депротеїнізація, причому при різних значеннях рН для дезокси-і рибонуклеопротеїдів. Обробка фенолом інактивує нуклеази, що дозволяє одержувати нуклеїнові кислоти у нативному стані.
1. Фенол - перегнаний, водонасичений, рН 6,0 та 8,3.
Фенол переганяють на піщаній чи олійній бані. У колбу Вюрца поміщають 88 г фенолу, 12 мл Н20, 100 мг алюмінієвих стружок і 50 мг iNaHC03. Збирають фракцію, що кипить при 183°С. При зберіганніу холодильнику фенол тривалий час не піддається окисленню. Перегнаний фенол поміщають у ділильну вирву, доливають рівний об'єм води, ретельно струшують і залишають на кілька годин. Після розшарування рідин шар фенолу обережно зливають у суху склянку. Фенол нейтралізують NaOH.
2. NaCl -0,14 М розчин, що містить 0,05 М цитрат калію.
3. Спирт етиловий абсолютний.
4. Ефір, що містить 6-7 крапель крижаної оцтової кислоти на 100 мл.
Усі операції слід проводити на холоді. Близько 20 г тканини (печінка, мозок, селезінка, див. виноску на с. 167), взятої після де-капітації (с. 221), подрібнюють ножицями і гомогенізують (або розтирають) в 10-кратному обсязі 0,14 М NaCl ( п. 2). Отриманий гомогенат фільтрують через 1-2 шари марлі. До фільтрату додають рівний об'єм фенолу 6,0 рН. Суміш інтенсивно струшують у колбі з притертою пробкою або ділильною лійкою протягом 40 хв і центрифугують на холоді (600g, 30 хв). Вміст пробірки (склянки) поділяється на 3 шари. Верхній (водний), що містить депротеїнізовану РНК, обережно відсмоктують за допомогою шприца в чисту колбу і зберігають. Середній шар, непрозорий, в'язкий, що містить дезоксирибонуклеопротеїди і нерозчинні в фенолі білки, відкидають. тканини) об'єм фенолу і хлористого натрію, суміш інтенсивно струшують і центрифугують, верхній водний шар обережно відсмоктують і з'єднують з першим, проміжний відсмоктують і використовують для отримання ДНК.
Виділення РНК. До водного розчину, що містить РНК, додають для додаткової депротеїнізаціїфенол рН 6,0 (1/2 об'єму) інтенсивно струшують 20 хв і центрифугують на холоді (600 g, 30 хв). Верхній шар відсмоктують і для осадження РНК доливають у склянку з потрійним об'ємом добре охолодженого етанолу і залишають у холодильнику на 1 год (не рекомендується в цій стадії залишати на більш тривалий час, так як можлива денатурація РНК) - Осад, що випав РНК збирають центрифугуванням на 3000 g, 10 хв) і потім розчиняють у невеликій кількості води. Осад, що не розчинився, видаляють центрифугуванням і відкидають. Препарат розливають на порції та зберігають у замороженому стані або в холодильнику з додаванням кількох крапель толуолу. Отриманий препарат РНК містить високо- та низькополімерну фракції.
Виділення ДНК. До проміжного шару, отриманого після повторної обробки фенолом (рН 6,0), додають водонасичений фенол (рН 8,3) у кількості, що дорівнює спочатку взятому (з розрахунком
та 10 мл на 1 г навішування тканини), струшують кілька хвилин, додають рівний об'єм води і перемішують 30-40 хв не дуже інтенсивно (круговими рухами). При цьому відбувається депротеїнізація і ДНК переходить у водну фазу. На цій стадії препарат може бути залишений на ніч у холодильнику. Потім суміш центрифугують на холоді (600 g, 30 хв). У центрифугаті утворюються три шари. Верхній водний шар, що містить ДНК, обережно відсмоктують за допомогою шприца; проміжний та фенольний шари струшують повторно з