Імовірні функції білків, що синтезуються при гіпотермії.
Є відносно мало даних про природу та функції білків, синтез яких стимулюється гіпотермією. У більшості робіт показана лише кореляція процесу загартовування до холоду із синтезом білка. У той самий час ця кореляція дозволяє припускати значної ролі білків у формуванні загартованого стану рослини. Передбачається, що одним із неодмінних факторів, потрібних для індукції морозостійкості озимого жита, є посилене утворення протоплазми та клітинних мембран.
У низці робіт показано вплив генів, локалізованих у певних хромосомах ядра, на активність мітохондрій при гіпотермії. Було встановлено, що охолодження морозостійких рослин озимих злаків спричиняє значні зміни в інтенсивності роботи дихального ланцюга мітохондрій та ступеня сполученості процесів окислення та фосфорилювання. Згодом був показаний ядерний контроль за проявом цієї ознаки, оскільки введення в малохолодостійкий генотип озимої пшениці хромосом з Х-геному високоморозостійкого пирію супроводжувалося реакцією мітохондрій на охолодження, типово для високоморозостійких форм, тобто швидким переходом в мітохондрій. Заміна ж хромосом Х-генома пирію на хромосоми пирійного D-генома в клітинах пшенично-пирійного гібриду уповільнювала цю реакцію мітохондрій на охолодження. Дослідження, проведені на мітохондріях 43 хромосомних ліній показали, що гени, що контролюють цю ознаку мітохондрії, локалізовані, ймовірно, у двох хромосомах Х-генома. Вивчення ліній з міжсортовим заміщенням хромосом, при якому всі пари хромосом D-генома, а також деякі хромосоми А- і В-геномів пшениці озимої Безоста 1 були заміщені на відповідні пари хромосомвисокоморозостійкої пшениці сорту Альбідум 114 показало, що тільки дві хромосоми геному пшениці Альбідум 114 контролюють енергетичну активність мітохондрій при гіпотермії. Таким чином, оскільки, як показано вище, блокування цитоплазматичного синтезу білка не дозволяє перети мітохондріям при гіпотермії в низькоенергетичний стан, можна висунути припущення, що ядро за допомогою зміни синтезу білків бере участь у регуляції мітохондріальної активності при гіпотермії.
Дегідрини таABA– регульовані білки
Останнім часом великий інтерес досліднику приваблює вивчення змін у синтезі дегідринів під впливом холодової акліматизації. Зміна транскрипції генів білків LEA, RAB та DHN була спочатку відзначена при дії водного стресу та після обробки рослин абсцизовою кислотою. Усі ці групи білків характеризуються високою гідрофільністю білкової молекули. Під час зневоднення клітини під дією водного стресу ці білки за рахунок своєї високо гідрофільності перешкоджають втратою клітиною води та стабілізують клітинні білки. Згодом було виявлено, що синтез цих білків посилюється під час холодової акліматизації. Дегідрини при цьому, мабуть, перешкоджають утворенню льоду в клітинах і стабілізують клітинні білки.
Серед білків, що накопичуються у рослинах у відповідь на зневоднювальну дію або дію низьких температур, найбільш інтенсивно досліджуються дегідрини сімейства LEA D II. Дегідрини складаються з різних типових для білків даного виду доменів, що з'єднуються в декілька найбільш поширених варіантів поліпептидів, а також численних варіацій, що рідко зустрічаються. Ці домени включають один або більше невеликих регіонів амфіпатичних альфаспіралейзалишків, залишки серину та N-термінальну послідовність. Досі невідомі всі біохімічні функції дегідринів, але значна кількість досліджень, присвячених з'ясування локалізації дегідринів у клітині за допомогою клітинного фракціонування та імунокалізації, встановили, що дегідрини можуть локалізуватися і в ядрі, і в цитоплазмі. Більш того, отримані дані показують, що цей клас білків асоціюється з макромолекулами нуклеопротеїнового комплексу в ядрі та мембранами цитоплазми. На даний момент вважають, що дегідрин є факторами, що запобігають коагуляції ряду макромолекул, зберігаючи їх структурну єдність під час стресового впливу.
Покращене відновлення проморожених меристем і калюсів смородини було отримано після 2 годин попередньо обробки в сахарозі, проліні, RAB – білках, або сироватковому альбуміні. Двогодинне занурення в 0.4 M RIB-SM до проморожування суттєво покращило відростання меристеми порівняно з 0, 1, 3 та 4 годинним зануренням. Двогодинне занурення меристем 5 і 10% пролін, розчинений в 0.4 M RIB-SM, значно покращило відростання після проморожування. Первинні тест з екстрактами сирого RAB P з насіння пшениці показав, що відростання проморожених апікальних меристем смородини покращується після 2 годин попередньо обробки зануренням з максимумом виживання в 1% RAB P. RAB P препарати, що містять еквівалентні білки, мали аналогічну дію на відростання, що вказує на те, що ефект залежав від присутності білків, а не цукрів та інших вуглеводів у сирих екстрактах RAB P. Аналогічні результати показують меристеми та калюси, попередньо оброблені 5 або 10% проліном, 1% розчином RAB P або 1% БСА в 0.4 M розчині цукрози. Попередньо оброблені меристемипродовжили приріст через 3 дні після зігрівання та досягли максимуму відростання через 1 тиждень, порівняно з 2 тижнями для попередньо необробленого контролю.
При дослідженні дії короткого дня на Betula pubescens було встановлено, що на додаток до різних конститутивних синтезованих дегідринів на короткому дні виявлялися два специфічні поліпептиди з молекулярними масами 34 і 36 кДа.
З бібліотеки кДНК, отриманої з коріння сходів проростків Triticum durum, підданих водному стресу, було охарактеризовано чотири клони дегідринів. Два їх, ptd27e і ptd16, кодують білки з класичними характеристиками дегідринів, тобто. консенсусним мотивом KIKEKLPG, який присутній за межами послідовності серинових залишків у карбоксильного кінця. Білки, що кодуються Tddhn15 і Tddhn16, мають подібність до послідовностей білків Triticum aestivum. Клони ptd25a і ptd38 кодують дегідрини, які не мають послідовності серинових залишків і мають схожість послідовності з Cor - білками T. aestivum. Щоб скорелювати стійкість T. durum до посухи з експресією генів дегідринів, для чотирьох сортів було проведено порівняння накопичення транскриптів дегідринів у коренях та пагонах сходів у відповідь на водний стрес та екзогенну абсцизову кислоту. Дослідження дії водного стресу в часі показало, що накопичення дегідринів транскриптів запізнюється в посухостійких сортах. При цьому рівень акумульованих транскриптів був більш високим у посухостійких, ніж у посухочутливих сортах. Аналогічні результати були відзначені після обробки екзогенної абсцизової кислоти.
Роль такого гормону, як абсцизова кислота у стійкості рослин до низьких температур, вивчалася у Arabidopsis шляхом використання.мутантів, у яких був змінений або біосинтез, або режим дії цього гормону. Різні мутанти використовувалися для аналізу ролі ABA у розвитку та проростанні насіння та стійкості до стресу. Мутанти були виділені переважною за зміненими характеристиками проростання та зростання проростків. Ген зеаксантинепоксидази, що кодується геном aba1, клонувався по гомології з геном Nicotiana plumbaginifolia, блокованим на тому ж біосинтетичному ступені. При цьому були виявлені біохімічні пошкодження мутантів aba1, aba2 та aba3. ABA-нечутливі мутанти також мають фенотип, на який впливають різні ABA-залежні процеси і, таким чином, дозволяють припускати, що вони або кодують ранні ступені передачі сигналу ABA, або вони впливають на специфічні ступені. Гени abi1 та abi2 кодують фермент протеінфосфатазу 2c і ген abi3 кодує фактор транскрипції зі специфічною експресією в насінні. Гіперчутливий до абсцизової кислоти мутант era1 має порушення у фарнезілтрансферазі.
Вдвічі було покращено відновлення кріоконсервованих in vitro кінців пагонів берези зависло за допомогою включення абсцизової кислоти до культурального середовища під час холодового загартовування материнських пагонів. Рівень відновлення кінців пагонів після холодового загартовування протягом 28 дні при +5 0C в 8/16 годинному фотоперіоді на середовищі, що містив 10 -4 M абсцизової кислоти був більше 40%. Абсцизова кислота була ефективно тільки в поєднанні з низькою температурою і коротко довжиною дня, хоча в ході експериментів і були відзначені великі генотипні відмінності. Абсцизова кислота мала два різні варіанти впливу: посилення холодової загартованості та посилення формування калюсу під час регенерації кріоконсервованих кінців пагонів.
Білки, що перешкоджаютьльодоутворенню
Однією з функцій білків, що синтезуються в рослинах при гіпотермії, зокрема, при дії негативних температур є перешкоджання процесу льдоутворення. Хоча, як було зазначено вище, в основному зниження температури початку льодоутворення відбувається за рахунок накопичення в рослинній клітині цукрів в результаті посилення синтезу та підвищення активності відповідних ферментів, у рослинних клітинах при гіпотермії відбувається також і синтез специфічних білків, що безпосередньо впливають на температуру початку льодоутворення зростання крижаних кристалів.
Здатність контролювати позаклітинне утворення льоду під час заморожування є критичною для виживання толерантних до заморожування рослин. Антифризні білки, які є білками, здатними гальмувати зростання кристалів льоду, нещодавно були ототожнені як найпоширеніші апопластні білки в листі акліматизованого до холоду озимого жита. Порівняння аміно-термінальних послідовностей, імуно-перехресної реактивності та ферментативної активності показали, що ці антифризні білки схожі з членами трьох класів білків, що належать до патогенезу, а саме, з ендохітіназами, ендо-бета-1,3-глюканазами та та . Апопластні ендохітінази та ендо-бета–1,3–глюканази сильно індукуються патогенами у чутливому до заморожування тютюнові та не мають антифризної активності. Отримані дані дозволяють пропонувати, що в патогенез-зв'язаних білках могли розвинутися тонкі структурні відмінності, які дозволили цим білкам отримати можливість зв'язуватися з льодом.
Антифризні білки мають здатність гальмувати утворення льоду. Для того, щоб пояснювати їх роль у цьому процесі, було проведено визначення їх концентрації таімунолокалізація цих білків у листі, пагонах і коренях озимого жита. Кожен із загальних розчинних білків, екстрагованих з акліматизованого до холоду житнього листя, стебла і коріння, мав антифризну активність, у той час як відсутність антифризної активності спостерігалася в екстрактах з неакліматизованих рослин жита. Антитіла, одержані проти трьох апопластних антифризних білків з жита, що відповідають глюконазоподібному білку, хітіназоподібному білку та тауматиноподібному білку, були використані для обробки відбитків тканин. При цьому було показано, що антифризні білки локалізуються в епідермісі та клітинах, що оточують міжклітинні простори, у акліматизованих до холоду рослин. Хоча GLP, CLP і TLP були присутні в неакліматизованих рослинах, вони виявлялися в інших місцях і не мали антифризної активності, що підтверджує, що при низько температурі виробляються інші ізоформи пов'язаних з патогенезом білків. Локалізація антифризних білків у жита може запобігати вторинному пошкодженню клітин епіфіпічним льодом або льодом, що поширюється через ксилему. Поширення білків, пов'язаних з патогенезом, і білків GLP, CLP і TLP, що накопичуються під дією холоду, аналогічно і може відображати загальні шляхи, якими як патогени, так і лід входять і поширюються по тканинах рослини.
Синтетично ген антифризного білка експресувався у рослинах і, як показали результати експериментів, знижував витік електроліту з листя при температурі замерзання ґрунту. Синтетично антифризний білок експресувався як злитий з сигнальним пептидом, що направляє його до міжклітинного простору, де спочатку проявляється кристалізація льоду. Ген був введений у Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Трансформанти ідентифікувалися за допомогою PCR – скринінгу та експресія введеного білка перевірялася імуноблотингом. Аналіз вивільнення електролітів з листя трансгенних рослин виявив кореляцію між рівнем експресії трансгенного білка та ступенем витривалості до замерзання ґрунту.
Застосування методик, заснованих на вивченні рекристалізації льоду, дозволило останнім часом встановити в ряді видів рослин наявність білків, які мають антифризну активність. Зокрема в корені акліматизованої до холоду моркви було виділено та ідентифіковано нові антифризний білок, що індукується холодом, з молекулярною масою 36 кДа. У ході вивчення його властивостей було встановлено, що цей білок пригнічує рекристалізацію льоду і має термогістерезисну активність.
Показано, що цей поліпептид існує у розчині у вигляді N-глікозильованого мономеру. Білок, як і інші відомі антифризні білки, локалізований в апопласті. Відповідний цьому білку ген, як показали результати досліджень, є унікальним та індукується холодом.
Регульовані холодом білки
Багато рослин, у тому числі Arabidopsis, збільшують стійкість до заморожування після впливу низьких температур, що не заморожують. Дана відповідь, звана холодовою акліматизацією, опосередкована ДНК-регулюючим елементом «C-повтор / посухочутливий елемент» і пов'язана з індукцією генів COR. Посилення експресії у Arabidopsis CBF1, транскрипційного активатора, що зв'язується з послідовністю CRT/DRE, індукувало експресію генів COR і збільшувало стійкість до заморожування неакліматизованих рослин Arabidopsis. На підставі цих даних було зроблено висновок, що CBF1 є ймовірним регулятором холодовоїакліматизації, що контролює рівень експресії генів COR, та сприяє підвищенню стійкості до проморожування.