КАПІЛЯРНИЙ ЕЛЕКТРОФОРЕЗ

Капілярний електрофорез – це фізичний метод аналізу.

ний на рухливості всередині капіляра заряджених частинок у розчині електро-

троліту під впливом прикладеного електричного поля.

Швидкість міграції частинок визначається їх електрофоретичною під-

вижністю та електроосмотичною рухливістю буферного розчину.

Електрофоретична рухливість речовини ( μ еф ) залежить від його ха-

рактеристик (електричного заряду, розмірів та форми) та від характеристик буферного середовища, в якому відбувається поділ (типу та іонної сили електроліту, рН, в'язкості та добавок):

ефективний заряд частки;

в'язкість розчину електроліту;

стоксівський радіус частки.

Електрофоретичну швидкість (v еф) для речовини сферичної форми

визначають за формулою:

сила електричного поля;

загальна довжина капіляра.

Коли до капіляра, заповненого буферним розчином,

електричне поле, усередині капіляра утворюється потік розчинника, нази-

ний електроосмотичним потоком. Швидкість і напрямок електроос-

мотичного потоку залежать від електроосмотичної рухливості ( μ эо ), оп-

ределяемой знаком і щільністю заряду на внутрішній стінці капіляра, а

також характеристиками буфера:

де: - Діелектрична константа буфера;

ζ – дзета потенціал поверхні капіляра.

Електроосмотичну швидкість (v ео) розраховують за формулою:

Електрофоретична та електроосмотична рухливість іонів мо-

гут бути спрямовані в одну і ту ж або в протилежні сторони в залежності

симості від заряду частинок; таким чином, швидкість руху розчиненої речовини будевизначатися рівнянням:

Якщо електроосмотична швидкість вище електрофоретичної, мож-

але одночасно розділити як позитивно, так і негативно заряджений

ні іони. Час, витрачений іоном для міграції від кінця, в якому введено

диться зразок, до місця детекції (l - ефективна довжина капіляра), визна-

ляють за формулою:

Більшість кварцових капілярів, що використовуються в електрофорезі,

несуть на внутрішній поверхні негативний заряд, створюючи електроос-

мотичний потік, спрямований до катода.

У деяких випадках необхідно зменшити або змінити напрямок.

ня електроосмотичного потоку. Для цього різним чином модифікації

ють внутрішню стінку капіляра або змінюють рН буферного розчину.

Після введення зразка в капіляр кожен аналізований іон дви-

ється всередині несучого електроліту відповідно до своєї електрофорети-

ної рухливістю. Ступінь розмивання кожної зони розчиненого со-

єднання визначається сукупністю різних причин. Найважливішою з

капілярний

них є поздовжня молекулярна дифузія розчину вздовж капіляра.

В ідеальному випадку ефективність поділу смуги, що характеризується числом теоретичних тарілок (N), виражається формулою:

де: D – молекулярний коефіцієнт дифузії розчиненої речовини у буфері.

На практиці на розмивання смуг значно впливають теплове роз-

сіяння, адсорбція зразка на стінці капіляра, різна провідність м е-

чекаю зразком і буфером, тривалість введення проби, розміри детектирую-

щої комірки і відмінності рівнів рідини в ємностях з буферними розчинами.

Поділ між двома смугами, званий роздільною здатністю ( R s ),оп-

вирізняють за формулою (8):

де: μ ефб і μ еоа

- електрофоретичні рухливості кожного з двох разів -

– їхня середня електрофоретична рухливість.

Середню електрофоретичну рухливість визначають за такою формулою:

= 0,5 ( μ ефб + μ ефа ).

Система для капілярного електрофорезу складається з високовольтного джерела напруги; двох флаконів з буферними розчинами і загр-

ними в них електродами; капіляра, заповненого відповідним розчином і зануреного обома кінцями у флакони з буферними рас-

творами; системи введення зразка; детектора, здатного в режимі реального часу реєструвати речовини, що проходять повз оптичний вікно

піляра; термостатичної системи; реєструючого приладу або підклю-

Для введення проби можуть використовуватися три способи: гідростатич-

ський – за рахунок різного рівня буферних розчинів, гідродинамічний – з

допомогою тиску або вакууму, що додається, і електрокінетичний – бла-

року додається напруги. В останньому випадку ступінь введення в ка-

піляр кожного компонента проби залежить від відповідної електрофо-

ретичної рухливості. Електрокінетична система введення для багато-

компонентної суміші з різною електрофоретичною рухливістю веде до зміни співвідношення концентрацій її складових і в даному випадку може адекватно застосовуватись лише для якісного аналізу. За умови визначення багатокомпонентної суміші одного або двох сполук цей метод може використовуватися і для кількісного аналізу. Крім того, та-

кий спосіб введення може дозволити збільшити чутливість аналізу.

Детектування здійснюється за допомогою абсорбційної спектро-

фотометріїв ультрафіолетовій (УФ) та видимій областях (ВО), флуоримет-

дії, кондуктометрії, амперометрії або

Для виявлення не поглинаючих в УФ світлі і флуоресціюючих сполук використовується непряме детектування. У цьому випадку у веду-

щий електроліт вводиться речовина, що поглинає УФ світло і утворює виражене фонове поглинання. При цьому зона речовини, що визначається, візуалізується у вигляді зворотного піку. З використанням спеціального програмного забезпечення електрофореграмі надають стандартного вигляду.

Використання певного капіляра, буферного розчину, методу попередньої підготовки капіляра, пробопідготовки та умов мігра-

ції вказуються у приватній фармакопейній статті. Застосовуваний розчин електроліту фільтрується для того, щоб видалити великі частинки, і дега-

зується для запобігання утворенню бульбашок повітря, які мо-

можуть бути перешкодою для детектуючої системи або можуть порушити електро-

провідність у капілярі під час проведення аналізу. Для хорошого відтворення

провідності часу міграції аналізованих компонентів проб для кож-

Дого визначення має бути розроблена певна про цедура про-

Основними формами проведення капілярного електрофорезу є-

ся: капілярний електрофорез у вільному розчині, міцелярна електро-

кінетична хроматографія, капілярний капілярне ізоелектричне фокусування та капілярний ізотахофорез.

Капілярний електрофорез у вільному розчині (КЕСР)

Аналізована проба поділяється в капілярі, що містить лише буферний розчин. Поділ відбувається за рахунок того, що різні ком-

поненти зразка рухаються з різними швидкостями, утворюючи так звані зони. Швидкість руху кожноїзони залежить від електрофоретичної під-

вижності розчиненої речовини і від електроосмотичного потоку в ка-

пілярі (див. розділ «Основні принципи»). Для зменшення адсорбції ве-

ств на кремнієвій поверхні можуть використовуватися капіляри з моди-

фікованою внутрішньою поверхнею.

Використання капілярного електрофорезу у вільному розчині по-

дозволяє виконати поділ як малих (молекулярна маса k )», що є відношенням молярних часток ана-

літа в міцелі та в рухомій фазі. Для нейтральної речовини k обчислюють за такою формулою: