Лабораторна діагностика грипу птахів
З 14 підтипів вірусу грипу А лише 3 виявляються у людини (Н1, Н2 та НЗ). Минуло вже 25 років відколи з людської популяції зник підтип Н2 вірусу грипу. При цьому ген ГА Н2 циркулює серед пташиних штамів вірусу грипу.
Поставити діагноз на грип птахів можна шляхом виділення вірусу та ідентифікації його в РЗК, РН і РТГА, а також виявлення специфічних AT в процесі епізоотії або після її (ретроспективна діагностика). У нашій країні біопромисловість випускає 2 діагностичні набори:
а) набір специфічних АГ та сироваток до них для діагностики грипу птахів 13 серотипів;
б) діагностичний набір для ідентифікації вірусу НБ та Ш (актуального епізоотичного типу).
Виділення вірусу.Взяття та підготовка матеріалу. Як виукраїновмісний матеріал використовують селезінку, головний мозок, синуси, трахею, легкі, повітроносні мішки, кишечник від хворого птаха або свіжих трупів. Матеріал до лабораторії доставляють у замороженому вигляді в термосі з льодом. Інфекційні титри вірусу в назальних змивах бувають максимальними через 2-4 дні після зараження птиці і досягають 105-107 ЕІДзо/мл змиву. Ізолювати віруси з клоочних змивів вдається найчастіше на 5-8-й день після експериментального зараження птиці.
Зараження курячих ембріонів. Випробувану суспензію інокулюють 9-10-дн КЕ (не менше 5 на одну пробу) в алантоїсну або амніотичну (краще) порожнини загальноприйнятим методом і інкубують протягом 72 год. Екстраембріональну рідину кожногоембріона роздільно перевіряють на ГА-активність краплинної РДА з 1% суспензією еритроцитів курей.
Розміщено на реф.рф За відсутності позитивної РДА проводять ще 3-5 сліпих пасажів, використовуючи для зараження КЕ ембріональну рідину попереднього пасажу. Якщо титри ГА низькі, проводять таким же чином ще 2-3 додаткові пасажі. Проба випробуваного матеріалу вважається негативною, якщо в 3-5 сліпих пасажах не буде виявлено ГА і патогенної дії вірусу (загибелі КЕ). За позитивної РДА проводять ідентифікацію виділеного вірусу.
Зараження культури клітин. Вірус після 2-5 пасажів добре розвивається у культурі фібробластів КЕ. ЦПД зазвичай проявляється через 24-48 год (залежно від дози та адаптації). Присутність його встановлюють за допомогою РДА та РДАд. Запропоновано прискорений метод титрування інфекційності вірусу грипу в культурі клітин шляхом підрахунку гемадсорбуючих клітин. Метод дозволяє отримати результат через 8 годин після зараження.
Біопроба на курчатах. Випробовувану суспензію інокулюють курчатам 2-3-місячного віку. Летальну інфекцію у курчат можна викликати за будь-якого методу зараження (підшкірно, внутрішньом'язово, мозок, кон'юнктиву) підтипами А1, А7 і А5. Зараження per os з кормом і водою вдається непостійно лише у разі високої патогенності епізоотичного ізоляту грипу. Заражені курчата, як правило, гинуть через 36-72 год залежно від дози та вірулентності збудника.
Індикація та ідентифікація вірусу. Для цієї мети широко використовують методи ІФ, цитоскопію, біопроб (на птиці та КЕ) та серологічну ідентифікацію. За допомогою монАТ можна ідентифікувати не лише різні групи вірусів (ВГП та ПМВ), а й визначати підтипи ВГП та серотипи ПМВ птахів, і навіть штами всередині одногопідтипу, а також локалізацію компонентів віріону в заражених клітинах (МРВГП – МА клонів 1С6, 5С10, N:2 – МА клони 303 і т.д.). На базі монАТ можна готувати діагностичні препарати для виявлення АГ та AT у РТГА, НІФ, РСК, ІФА та ін.
Розміщено на реф.рф реакціях.
РДА. Для індикації вірусу у патологічному матеріалі можна використовувати РДА. Надосадову рідину після центрифугування суспензії проб з органів і тканин хворого птаха, а також змивів досліджують у краплинній або пробірковій РДА з 1% суспензією еритроцитів курей або 0,5% суспензією еритроцитів морської свинки. Реакцію враховують через 20 хв та 1 год. Специфічність визначають у РТГА.
цитоскопія. Метод полягає у дослідженні тканинних елементів у відбитках, отриманих зі слизової оболонки верхніх дихальних шляхів (краще) та органів. Препарати висушують і забарвлюють одним з методів: за Романівським, Пигаревським, Биковським і т. п. При забарвленні за Биковським та Пігаревським у цитоплазмі клітин при грипі зазвичай виявляють тільця-вмикання яскраво-червоного кольору; при фарбуванні по Романівському – фіолетового кольору. Внутрішньоклітинні включення знаходять не тільки в клітинах циліндричного епітелію, але і в цитоплазмі макрофагів, лейкоцитів та плоского епітелію. В даний час даний принцип дослідження використовується із застосуванням люмінесцентної мікроскопії.
Метод простого флюорохромування. На мазки-відбитки з органів і змивів наносять 1-2 краплі робочого розчину акридину помаранчевого (1:10000), покривають покривним склом і свіжий препарат (протягом 10 хв після приготування) розглядають у люмінесцентному мікроскопі. Ядра клітин виявляються по смарагдово-зеленому світінню, РНК плазми клітин - у вигляді не різко обмежених гранул червоного або помаранчевого кольору. Упрепараті, що має вірус грипу, виявляються включення у вигляді чітко відмежованих яскраво-червоних гранул у цитоплазмі клітин