Ліпосоми та протитуберкульозна терапія, Використання ліпосом у хіміотерапії при онкозахворюваннях
Ліпосоми та протитуберкульозна терапія
При туберкульозному запаленні утворюються гранульоми, які складаються з клітин імунної системи макрофагів, набитих мікобактеріями туберкульозу. Тому макрофаги необхідно доставити ліки. Адресна доставка дозволить знизити токсичне навантаження на печінку. Макрофаги мають здатність заковтувати дрібні частинки, тому пропоновані ліки, гідразид нікотинової кислоти, упаковують в ліпосоми. Новосибірські вчені створили молекулярно-ліпосомальні гібридні композиції (МЛГК) розміром від 200 до 450 нм, які містять окислені декстрани, пов'язані з ліками. Наразі дослідники перевіряють, які фактори можуть вплинути на ефективність заковтування МЛГК фагоцитами.
Вчені провели експерименти на мишачих макрофагах. Клітини обробили ферментами та сполуками, які теоретично могли б перешкодити макрофагам поглинати ліпосоми. Процес поглинання можна умовно розділити на дві стадії: спочатку МЛГК налипають на клітини, а потім потрапляють усередину. Виявилося, що злущування з поверхні фагоцитів білкових молекул, здатних виконувати функції рецепторів, не відіграє ролі у прилипанні МЛГК до мембран клітин. Дещо послабити цей процес може знижений метаболізм у клітинних мембранах.
Використання ліпосом у хіміотерапії при онкозахворюваннях
Стандартною екструзією через калібровані ядерні мембрани отримані стабільні ліпосоми середнього діаметра 100 нм на основі природних фосфоліпідів та ліпофільних проліків широко застосовуваних хіміотерапевтичних засобів – метотрексату та мелфалану. Ліпосоми показали ефективність системного введення мишам з експериментальними пухлинами. Фармакокінетика метотрексату в плазмі мишей свідчить про переваги його застосування у вигляділіпофільних проліків у ліпосомах.
Відкриття явища пасивного транспорту частинок приблизно 100-нм розмірів в пухлини та вогнища запалення [1] послужило імпульсом для бурхливого розвитку досліджень у галузі розробки систем доставки ліків. Застосування нанотехнологій є загальновизнаною у світі стратегією розвитку фармацевтичного виробництва на найближчі десятиліття. Включення ліків у біосумісні полімерні або супрамолекулярні носії зменшує концентрацію вільних препаратів у кровотоку та перешкоджає їх швидкому виведенню нирковою системою, що дозволяє зменшити загальну токсичність та збільшити терапевтичний індекс за рахунок покращення фармакокінетики та біорозподілу. Накопичення нанорозмірних носіїв в пухлинах і вогнищах запалення здійснюється завдяки дефектній архітектурі судинної системи, що формуєтьсяde novo, і підвищеній проникності її ендотелію. У той же час, високий інтерстиціальний тиск у солідних (твердих) пухлинах не дозволяє утримуватись у них часткам з розмірами менше 30-40 нм (ефект enhanced permeability and retention). Оптимальний обсяг носіїв, що забезпечує пасивний транспорт ліків, потрапляє в інтервал 50-150 нм. Ліпосоми, поряд з ліпідними наносферами, відносяться до найбільш біо-і гемосумісних носіїв і придатні для системного введення в організм. Ліпосоми понад 30 років тому привернули увагу як системи доставки ліків. Дослідження отримали новий імпульс після розробки технології одержання ліпосом Stealth® [2]. Поверхня таких ліпосом захищена від опсонізації (адсорбції білків плазми) та передчасного виведення з кровотоку клітинами імунної системи завдяки екрануванню щепленими високогідратованими залишками поліетиленгліколю. Препарати на основі Stealth-ліпосомзастосовуються у клініці вже понад 10 років: наприклад, ліпосоми з доксорубіцином (Doxil, Caelix та ін. виробництва США, країн ЄС, України) – для лікування саркоми Капоші та раку яєчників [3]. Однак створення подібних конструкцій для широкого спектру водорозчинних засобів виявилося неможливим, оскільки метод активного завантаження, що застосовується при їх виробництві, придатний лише для обмеженої кількості ліків, що мають природу слабких амфіфільних кислот або основ (наприклад, антибіотики ряду антрациклінового типу доксорубіцину). Альтернативний лабораторний спосіб - формування ліпосом у водно-сольовому розчині ліки з подальшим відділенням від агента, що не включився, - нетехнологічний.
Ми пропонуємо включати ліки в ліпідний бішар ліпосом у вигляді ліпідних похідних - ліпофільних проліків, які розщеплюються внутрішньоклітинними ферментами з вивільненням вихідного препарату. Такий підхід спрощує технологію отримання лікарських ліпосом та робить її універсальною. Більше того, порівняно з інкапсулюванням у водний об'єм ліпосом, включення в бішар дозволяє поліпшити фармакологічні властивості системи доставки в цілому завдяки зменшенню втрат ліків як у кровотоку, так і при взаємодії ліпосоми з клітиною. Очевидно також, що ліпідні похідні здатні до прямого трансмембранного перенесення, що кардинально змінює механізм ендоцитозу та внутрішньоклітинного трафіку препарату та полегшує розвантаження ліпосом. Для порівняння, щоб забезпечити вихід ліків з водного об'єму Stealth-ліпосом після їх потрапляння в ендосоми клітини-мішені, пропонується використовувати рН-чутливі молекулярні тригери, у тому числі пептидні, фосфоліпідні та ін. Низька ефективність внутрішньоклітинного розвантаження, обумовлена жорсткістю ліпідного бісла його фазовогопереходу перевищує 60С) та утрудненим злиттям з клітинними мембранами – один із суттєвих недоліків Stealth-ліпосом.
Нами розроблені синтези ліпідних похідних широко застосовуваних у клініці хіміотерапевтичних засобів: мелфалану (і його рацемату сарколізину) та метотрексату [4, 5]. Цитотоксик мелфалан – алкілюючий агент, що діє незалежно від стадії клітинного циклу, – застосовується в хіміотерапії майже 50 років. Цитостатик метотрексат, антиметаболіт фолієвої кислоти, також давно використовується для лікування онкологічних та аутоімунних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, де він, як і раніше, залишається «ліками номер один». Зв'язок між ліками та рештою молекули проліки повинен легко гідролізуватися всередині клітини. Оскільки естерази мають меншу специфічність, ніж амідази, і широко представлені у всіх органах і тканинах, переважний складноефірний зв'язок, а не амідний. Крім того, при розробці молекулярних структур ліпідних кон'югатів враховувалася їх найкраща відповідність упаковці ліпідного бислоя ліпосом (рис. 1).
Мал. 3.Молекулярні структури ліпідних кон'югатів ліків та схематичне зображення лікарської ліпосоми
Ліпосоми з проліками формуються стандартним методом екструзії: ліпідні плівки, отримані із суміші всіх амфіфільних компонентів (яєчний фосфатидилхолін, фосфатидилінозит з пекарських дріжджів і проліки), піддаються гідратації буферним фізрозчином, потім 0 -20-кратної екструзії при температурі не вище +40С через полікарбонатні мембранні фільтри з розмірами пір 100 нм. Для екструзії ми використовуємо установку фірми Lipex (Канада) при тиску азоту до 50 ат або ручний екструдер Avanti (США),в залежності від кількості потрібних препаратів. На рис. 2 наведені електронні мікрофотографії дисперсій ліпосом, отримані методом заморожування-сколювання, який найбільш адекватно відображає розміри та структуру вихідних ліпосом у водній фазі [6].
Мал. 4.Електронні мікрофотографії реплік з поверхонь сколу заморожених дисперсій ліпосом, навантажених:А,а- ліпідним кон'югатом метотрексату;Б,б- ліпідним кон'югатом мелфалану
Очевидно, що ліпосоми, що містять до 10 мол. % ліпофільних проліків, дійсно являють собою моноламелярні везикули діаметром до 100 нм. Відомо, що фосфатидилінозит стабілізує мембрану ліпосом, подібно до залишків полімеру в Stealth-ліпосомах. Ми вважаємо, що цей природний фосфоліпід не повинен викликати небажаних побічних ефектів, які супроводжують повторне застосування ліпосом з поліетиленгліколем [7].
Фізико-хімічна стабільність ліпосом досліджена нами за допомогою динамічного лазерного світлорозсіювання, електронної мікроскопії та гель-хроматографії у поєднанні зі спектрофотометричним аналізом на хромофори ліків та ліпідний фосфор. Показано, що проліки повністю (навантаження ліпідного бісла до 10 мол. %) вбудовуються в мембрану ліпосом і утворюють стабільні дисперсії, що містять лікарський початок у концентраціях, придатних для системного введення тварин. Такі дисперсії можна зберігати кілька днів при +4 С. Однак самі ліки, особливо залишок мелфалану, у водному середовищі зазнають поступової деградації. Для тривалого зберігання дисперсії можна заморожувати при -196 ° С і зберігати при температурах нижче -20 °C; перед застосуванням їх необхідно розморозити та короткочасно обробити на ультразвуковій бані. Справді,агрегати ліпосом, що утворилися після розморожування дисперсій (рис. 3,б), диспергуються з відновленням вихідних нанорозмірних ліпосом (рис. 3,в).
Мал. 5.Електронні мікрофотографії ліпосом з ліпофільним проліком мелфалану (метод негативного контрастування):
а- через 20 годин після отримання;б -після розморожування заморожених у рідкому азоті дисперсій;в -після обробки розморожених дисперсій на ультразвуковій бані
Склад ліпосом при цьому також зберігається: ліпофільне проліки не виділяються з ліпідного бислоя ліпосом в окремі агрегати [6]. Таким чином, глибоке заморожування без кріопротекторів може бути одним із способів тривалого зберігання ліпосомальних препаратів з ліпідними кон'югатами мелфалану та метотрексату.
Інше питання: яка стабільність складноефірних зв'язків ліпофільних проліків після внутрішньовенного введення ліпосомальних дисперсій? На прикладі кон'югату метотрексату нами показано, що проліки у складі ліпосом стійкі до передчасного гідролізу естеразами плазми людини [8]. Дійсно, високоефективна рідинна хроматографія зі спектрофотометричним детектуванням продемонструвала стабільність проліків метотрексату при інкубаціїin vitroу плазмі крові аж до 24 год. Очевидно, ліпосоми захищають складноефірні кон'югати від дії позаклітин.
Проведено першу серію експериментів з вивчення фармакокінетики ліпосомального кон'югату метотрексату. У РОНЦ РАМН розроблено та широко застосовується в клініці метод аналізу фармакокінетики метотрексату та продукту його метаболізму 7-гідроксиметотрексату за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Дослідження, проведені нами на контрольнійгрупі мишей СВАхC57Bl/6(F1), показали, що фармакокінетика метотрексату при внутрішньовенному введенні в еквівалентній дозі (10 мг/кг) значно відрізняється від такої для кон'югату метотрексату в ліпосомах. Зазначимо, що методика проведення хроматографічного аналізу кон'югату метотрексату до кінця не розроблена і має бути оптимізована. Проте перші результати показують перспективність ліпосомального препарату. Наведемо деякі дані. Період напіввиведення кон'югату метотрексату, що відповідає швидкій фазі розподілу по органах та тканинах, у дев'ять разів вищий, ніж інтактного метотрексату (3,6 проти 0,4 хв). Період напіввиведення з плазми кон'югату перевищує майже в 3,5 рази показник для вихідних ліків (40 хв проти 12). Наступне утворення власне метотрексату з проліків відбувається набагато більш уповільнено, в результаті період його напіввиведення значно збільшується і становить 196 хв порівняно з 12 хв при введенні інтактних ліків. Таким чином, ліпосомальний препарат є пролонгованою формою метотрексату. Наведені результати можуть свідчити про більш високий терапевтичний потенціал нової лікарської форми метотрексату у вигляді дигліцеридного кон'югату, укладеного в ліпосоми, при таких системних гематологічних захворюваннях, як злоякісні лейкози та лімфоми. Доказом цього припущення є той факт, що при введенні ліпосомального препарату величина експозиційної дози в сироватці крові за метотрексатом перевищувала більш ніж удвічі таку після введення ліків в еквівалентній дозі.
Терапевтична ефективність ліпосом з ліпофільними проліками показана намиin vivoна моделях раку молочних залоз та лімфолейкозів. Збільшення тривалостіжиття мишей з перевитим лейкозом Р-388 при лікуванні ліпосомальним препаратом дигліцеридного кон'югату сарколізину зросло в 1,5 рази, порівняно з лікуванням інтактними ліками [9], а при лікуванні мишей BLRB з перевитим раком молочних залоз цей показник збільшився в два рази ]. Нещодавно нами проведено короткочасне лікування гострого Т-лімфолейкозу мишей метотрексатом та ліпосомальними препаратами кон'югату метотрексату. Ця модель лімфолейкозу виявляє подібність до Т-клітинних лімфом людини, які дуже агресивні і важко піддаються хіміотерапевтичному лікуванню. Проте навіть у режимі помірної терапії ліпосоми з кон'югатом метотрексату показали покращення виживання порівняно з вихідними ліками майже на 10%. Необхідні подальші дослідження для оптимізації режимів лікування (дози, кількість ін'єкцій тощо) та дослідження фармакокінетики та біорозподілу лікарських ліпосом, які вже зарекомендували себе як перспективну систему доставки для наномедицини.