Механізми репарації ДНК - Механізми виживання бактерій у навколишньому середовищі.
В основі радіорезистентності бактерій лежать різноманітні внутрішньоклітинні процеси, що беруть участь у репарації пошкодженої ДНК. Велику цінність для дослідження цих процесів становить наявність добре охарактеризованих мутантних штамів, радіаційна чутливість яких варіює у надзвичайно широких межах.
За допомогою генетичних схрещувань було отримано подвійні та потрійні мутанти дріжджів, у яких репаративна активність повністю відсутня. Порівняльне дослідження штаму дикого типу і надчутливих подвійних і потрійних мутантів S. сеrevisiae показало, що якщо нормальний штам досить легко переносить освіту в ДНК майже 16 000 димерів (37% виживання), то подвійні та потрійні мутанти залишаються резистентними у присутності димер відповідно. Знижена резистентність таких подвійних і потрійних мутантів є переконливим свідченням на користь різних шляхів репарації радіаційних пошкоджень.
Залежно від того, чи бере видиме світло в модифікації пошкоджень ДНК, репарацію можна поділити на світлову і темнову. Саме під світловою репарацією розуміється феномен фотореактивації, вперше описаний в актиноміцетів. Механізм фотореактивації діє лише на піримідинові димери. У цьому процесі бере участь фермент фотореактивації, який зв'язується з димерами. Фермент-субстратний комплекс, що утворюється, активується видимим світлом, що призводить до мономеризації димерів in situ. Таким чином, летальний ефект УФ-опромінення істотно знижується, якщо опромінені клітини піддаються впливу видимого світла з довжинами хвиль від 360 до 420 нм (див. рис. 6.1).
Мал. 6.1 Світлова репарація ДНК
Фотореактивація є потужнимінструментом дослідження летальних та мутаційних ушкоджень, оскільки їх репарація під впливом світла може бути використана як критерій для вирішення питання про те, чи обумовлена інактивація ДНК утворенням піримідинових димерів.
До іншого типу реактивації клітин видимим світлом належить його захисну дію. У цьому випадку збільшення виживання клітин спостерігається при освітленні їх видимим світлом перед УФ-опроміненням. Цей феномен пояснюють тим, що видиме світло індукує затримку клітинного поділу. Внаслідок такої затримки залишається більше часу для репарації пошкоджень, що викликаються УФ-опроміненням (див. рис. 6.2).
Мал. 6.2 Залежність виживання клітин бактерій від величини опромінення
Під «темновою репарацією» розуміють репарацію без світла. В даний час відомі дві системи такого типу: ексцизійна репарація та постреплікативна рекомбінаційна репарація. Репарація першого типу вимагає присутності ферментів, які дізнаються про порушення структури ДНК, видаляють порушені ділянки, заміняючи їх нормальними нуклеотидними послідовностями, і, нарешті, відновлюють початкову структуру ДНК, замикаючи полінуклеотидний ланцюг (див. рис. 6.3).
Мал. 6.3Темнова репарація ДНК
Дія різноманітних інактивуючих агентів на клітини може призводити до виникнення ДНК цілого ряду різних пошкоджень. Детальне вивчення системи ексцизійної репарації стало можливим завдяки наявності радіаційно-чутливих мутантів, за допомогою яких вдалося виділити та охарактеризувати специфічні ферменти, що беруть участь у різних стадіях цього процесу. У Е. coli є принаймні чотири таких етапи. На першому етапі відбувається розрив ланцюга ДНК поблизу пошкодження під дієюендонуклеази, що дізнається про порушення структури ДНК. Така УФ-специфічна ендонуклеаза була виділена з Micrococcus luteus та Е. coli. За розривом ланцюга ДНК слід видалення піримідинових димерів, яке здійснюється екзонуклеазою. Видалення димерів супроводжується додатковою деградацією ДНК з утворенням проломів, розміри яких варіюють від 20 до 400 нуклеотидів. Потім проломи заповнюються за допомогою ДНК-полімерази, що використовує як матрицю інтактну комплементарну ланцюг ДНК. Заключний крок у цій послідовності події полягає у відновленні цілісності полінуклеотидного ланцюга внаслідок зшивання розриву лігазою.
Генна інженерія виникла в 70-80 роки 20 століття. Генна інженерія – розділ молекулярної генетики, пов'язаний із цілеспрямованим конструюванням нових неіснуючих у природі поєднань генів. ЗАВДАННЯ ГЕННОЇ ІНЖЕНЕРІЇ: розшифровка структури генів, синтез ге.