Методи визначення цитокінів
Методи визначення цитокінів - розділ Медицина, Методи оцінки імунного статусу навчальний посібник для студентів лікувального, педіатричного та медико-профілактичного факультетів Визначення Змісту Цитокінів У різних Біологічних Рідинах Має Бо.
Визначення вмісту цитокінів у різних біологічних рідинах має велике значення в оцінці функціональної активності імунокомпетентних клітин та регуляції імунної відповіді. В окремих випадках (септичний шок, бактеріальний менінгіт), коли цитокіни, зокрема ФНПα, виступає як провідний фактор патогенезу, визначення його вмісту в крові або спинномозковій рідині стає основним методом імунологічної діагностики. Іноді рівень цитокінів визначають із метою диференціальної діагностики. Наприклад, при бактеріальному менінгіті в спинномозковій рідині визначається ФНПα, а при вірусних менінгітах у ній виявляється, як правило, лише ІЛ-1. Однак визначення присутності цитокінів у сироватці крові та інших біологічних рідин може давати негативні результати у зв'язку з особливостями цих пептидів. Будучи переважно короткоживучими регуляторами, цитокіни мають невеликий напівперіод життя (до 10 хв). Деякі цитокіни містяться в крові в украй низьких концентраціях, накопичуючись в основному в осередку запалення, крім того, біологічна активність цитокінів може маскуватися при зв'язуванні їх з молекулами інгібіторів, що циркулюють у крові.
Існуючі два методичні підходи до виявлення та кількісного визначення цитокінів у біологічних рідинах – біологічний та імунохімічний (ІФА) – мають кожен свої недоліки.
Тестування з біологічних ефектів, як правило, недостатньо чутливе та іноді недостатньо інформативно.Присутність у тій біологічній рідині молекул інгібіторів або антагоністів може маскувати біологічну активність цитокінів. При цьому нерідко різні цитокіни виявляють однакову біологічну активність. Крім того, постановка біологічних тестів потребує спеціального додаткового оснащення, проводиться у нестандартних умовах та використовується переважно у науково-дослідних цілях.
Біологічні методи розроблені для визначення активності ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІФНγ, ФНПα. Біологічне тестування ІЛ-1 засноване на його здатності стимулювати проліферацію мишачих тимоцитів лінії C3H/He, стимульованих до проліферації мітогенами, інтенсивність якої оцінюють реакції бласттрансформації за включенням міченого ізотопом тимідину. Додавання відповідних МКАТ до цитокінів у культурі блокує їхню біологічну активність, що є доказом того, що сигналом до проліферації клітинної лінії служить цитокін.
Активність ФНП оцінюють за цитотоксичною дією на лінію трансформованих фібробластів мишей L-929 з визначенням інтенсивності руйнування клітин в культурі. За умовну одиницю ФНП приймають розведення досліджуваного зразка, необхідне для отримання 50% клітинної цитотоксичності.
Для визначення біологічної активності інтерферону (ІФН) у досліджуваних рідинах проводять їх титрування на диплоїдній культурі фібробластів людини М19 у присутності везикулярного вірусу стоматиту. У відсутності ІФН віруси викликають деструкцію моношару. За одиницю активності ІФН приймають величину, що пригнічує деструкцію моношару на 50%. Для визначення типу ІФН до системи додають специфічну антисироватку проти ІФНα, ІФНβ або ІФНγ. Антисироватка скасовує дію відповідного ІФН, що дозволяєідентифікувати його тип.
Біоаналіз для визначення ІЛ-2 заснований на здатності цитокінів підтримувати зростання Т - лімфоцитів, стимульованих мітогеном, та підтримувати тривале зростання ІЛ-2 залежної лінії Т-клітин у культурі CTLL (лінія цитотоксичних Т-лімфоцитів). При оцінці активності ІЛ-4 враховують його стимулюючий вплив на синтез ДНК у клітинах, стимульованих до проліферації антитілами до Ig M.
Більшого поширення набуло визначення цитокіну в сироватці крові та інших біологічних матеріалах за допомогою твердофазного ІФА. Дослідження проводиться відповідно до протоколу, що додається до діагностичної тест-системи. Найчастіше застосовують варіант сендвіч-ELISA, який полягає в наступному: один тип МКАТ до певного цитокіну іммобілізується на внутрішній поверхні клітин планшетів для дослідження. У лунки планшета вносять досліджуваний матеріал та відповідні стандарти та контролі. Після інкубації та промивання в лунки вносять другі МКАТ до іншого епітопу даного цитокіну, кон'юговані з індикаторним ферментом (пероксидазою хрону). Після інкубації та промивання в осередки вносять субстрат-перекис водню з хромогеном. У процесі ферментативної реакції змінюється інтенсивність фарбування лунок, яке вимірюють на автоматичному фотометрі для планшетів.
ІФА із застосуванням МКАТ проти окремих епітопів у молекулі цитокінів відрізняється високою чутливістю та специфічністю, крім того, перевагою методу є об'єктивний автоматизований облік результатів. Однак цей метод також не позбавлений недоліків, оскільки виявлення присутності молекул цитокінів ще не є показником їх біологічної активності, можливість хибнопозитивних результатів через перехресно реагують антигенні епітопи, використання ІФА не даєможливості визначення цитокінів у складі імунних комплексів