Методи визначення вмісту холестерину сироватки крові
Методи визначення загального холестерину поділяються на:
1) колориметричні. Налічується близько 150 колориметричних методів, що ґрунтуються на реакціях утворення кольорових комплексів;
2) нефелометричні методи, засновані на порівнянні ступеня каламутності стандартного та досліджуваного розчину;
3) титрометричні методи;
4) флюориметричні методи, що дозволяють визначати холестерин у мікрооб'ємах сироватки крові (наприклад, 0,01 мл її);
5) газохроматографічні та хроматографічні методи;
6) гравіметричні методи.
Метод визначення загального холестерину в сироватці крові, заснований на реакції Лібермана-Бурхарда (метод Ілька)
Принцип методуУ сильнокислому безводному середовищі ХС взаємодіє з сумішшю сірчаної, оцтової кислот та оцтового ангідриду. Під час реакції ХС послідовно окислюється. При цьому кожна стадія реакції супроводжується утворенням молекули холестерину, яка має на один подвійний зв'язок більше, ніж з'єднання, з якого вона утворилася. В результаті кінцевого окислення іона 3,5-холестодієну виходить забарвлена сполука, розчинена в сірчаній кислоті і дає максимум абсорбції при 410 і 610 нм. Через нестійкість забарвлення з'єднання час фотометрування має бути точно витриманим.
Реакційна суміш із стандартним розчином ХС має смарагдовий колір. Однак проби сироватки можуть надавати зелений, блакитний, бурий кольори. Це пов'язано з тим, що внаслідок утворення ендогенного тепла в реакцію вступають багато компонентів сироватки крові. Крім того, у реакції Лібермана-Бурхарда вільний ХС та його ефіри утворюють кольорові комплекси з різним коефіцієнтом молекулярного поглинання. У разі високого вмісту ефірів ХС оптична щільність виявляється більшою.високою. Оскільки на пряме визначення холестерину впливають багато факторів, реакцію холестерину з сумішшю Лібермана-Бурхарда не можна вважати специфічною.
Прямий метод визначення ХС щодо простий у виконанні та недорогий. Однак токсичність та здатність викликати корозію системи у сучасних аналізаторах обмежують застосування методу. У великих лабораторіях перевагу надають ферментативним методам визначення холестерину.
Референтні величини: холестерин 4,65-6,46 ммоль/л (180-250 мг/дл).
При концентрації холестерину в пробі вище 16 ммоль/л розводять сироватку фізіологічним розчином у співвідношенні 1 : 1 (результат).
Реакція чутлива на зміну температури, тому необхідно особливо дотримуватись охолодження реакційної суміші після добавки сірчаної кислоти.
Білірубін у концентрації вище 50 мкмоль/л впливає результат аналізу. Інтерференцію білірубіну можна виправити розрахунком. Вміст 17 мкмоль/л білірубіну призводить до підвищення вмісту холестерину в сироватці приблизно на 0,1 моль/л.
Сироватка має бути негемолізованою.
1. Крижана оцтова кислота.
2. Концентрована сірчана кислота.
3. Оцтовий ангідрид.
4. Абсолютний етиловий спирт.
5. Кислотна суміш: в суху колбу наливають 10 мл крижаної оцтової кислоти і 50 мл оцтового ангідриду, потім при постійному перемішуванні та охолодженні додають 10 мл концентрованої сірчаної кислоти. Суміш має бути безбарвною або злегка жовтуватою. Зберігати у холодильнику у темній склянці з притертою пробкою.
6. Калібрувальний розчин: 232 мг холестерину розчиняють у 2-3 мл хлороформу та доводять до об'єму 100 мл абсолютним етиловим спиртом. Приготовлений розчин містить холестерин у концентрації 6 ммоль/л.
Хід визначенняДо 2,1мл кислотної суміші повільно по стінці пробірки додають 0,1 мл плазми або сироватки без ознак гемолізу, перемішують струшуванням і ставлять на 20 хв термостат або водяну баню при температурі 37 °С, потім фотометрируют в кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5 см проти реактиву при довжині хвилі 625 нм.
Побудова калібрувальної кривої та розрахунок. До 0,05-0,2 мл калібрувального розчину додають таку кількість кислотної суміші, щоб загальний обсяг був 2,2 мл, перемішують і витримують 20 хв при температурі 37 °С, так само як і дослідні проби, а потім фотометрують. Забарвлення калібрувальної проби, в яку взято 0,05 мл калібрувального розчину, відповідає вмісту холестерину в плазмі 3 ммоль/л, проби, в яку взято 0,1 мл, вмісту 6 ммоль/л і т.д.
1. Попадання води призводить до помутніння розчину.
2. Сліди гемолізу або жовтушність досліджуваної плазми або сироватки спричиняють підвищені результати.
3. Можна використовувати для фотометрії та кювети з довжиною оптичного шляху 1 см, тоді кількість кислотної суміші подвоюють, а кількість досліджуваного матеріалу залишається незмінною.
Метод визначення вмісту холестерину в сироватці крові, заснований на холестеролоксидазній реакції
Принцип методуХолестерин та його ефіри виділяються з ліпопротеїнів детергентами. Холестерінестераза гідролізує ефіри. Внаслідок подальшого ферментативного окислення холестерину холестериноксидазою утворюється Н2О2.
Ефір холестерину + Н2О2 ↔ холестерин + жирні кислоти;
Холестерин + О2 ↔ холестен-3-ОН + Н2О2;
Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аміноантипірін ↔ хіноніміновий барвник + Н2О2.
Рівні норми холестерину, виявлені під час обстеження “загалом здорового населення”, щодо високі. З погляду ризикурозвитку ішемічної хвороби серця рівні ХС бажані:
2) помірний ризик - 5,18-6,19 ммоль/л;
3) високий ризик – понад 6,22 ммоль/л.
Клініко-діагностичне значенняЗбільшення концентрації ХС спостерігається при полігенній гіперліпопротеїдемії типу II А і II Б, III, гіперліпопротеїдемії I, IV, V типів, вторинної, набутої гіперліпопротеїдемії, відзначається також при захворюваннях печінки, внутрішньо- та позапечінковому холестазі, гломерулонефриті, нефротичному синдромі, ХНН, злоякісних пухлинах підшлункової залози, простати, гіпотиреозі, подагрі, ІХС, вагітності, діабеті, алкоголізмі, анальбумінемії, дисглобулінемії, гострій перемежовці.
Зниження концентрації холестерину виявлено при дефіциті α-ліпопротеїду (хвороба Танжера), гіпо- та а-β-ліпопротеїдемії, некрозі печінкових клітин, злоякісних пухлинах печінки, гіпертиреозі, порушенні всмоктування, порушенні харчування, мегалобластної анемії, сідер , обширних опіках, хронічних обструктивних захворюваннях легень, розумової відсталості, ревматоїдному артриті, лімфангіоектазії кишечника.
Відзначені сезонні коливання рівня ХС, вищі восени та взимку, нижчі навесні та влітку. Повторне визначення холестерину після інфаркту міокарда необхідно проводити через три місяці.
Метод визначення вмісту ліпопротеїнів високої щільності у сироватці крові
Ліпопротеїни дуже низької щільності (ЛПДНЩ) і низької щільності (ЛПНЩ) на противагу ліпопротеїнам високої щільності (ЛПЗЩ) утворюють нерозчинні комплекси з гепарином у присутності іонів марганцю. У надосадовій рідині, що залишилася після осадження ЛПНЩ та ЛПДНЩ, залишається α-холестерин або ЛПВЩ.
Рекомендуються наступні показникиоцінки ймовірності розвитку атеросклерозу (табл. 8)
Хіломікрони, ЛПДНЩ (ліпопротеїни дуже низької щільності) та ЛПНЩ (ліпопротеїни низької щільності) осаджуються додаванням фосфорно-вольфрамової кислоти і хлориду магнію.
Отримані значення достовірні, якщо:
1) у пробі немає хіломікронів;
2) концентрація триацилгліцеридів не перевищує 400 мг/100 мл;
3) у пробах не виявляється слідів III типу дисліпопротеїнемії.
При вимірі Hg 546 нм відбувається завищення кількості ЛПВЩ холестерину спектром поглинання гемоглобіну, яке можна ігнорувати при значеннях до 200 мг Нb/100 мл.
Отриманий при центрифугуванні супернатант має бути прозорим. Якщо проба містить велику кількість тригліцеридів (понад 1000 мг/100 мл), осадження ліпопротеїнів може бути неповним (каламутний супернатант) або частина осаду може плавати на поверхні. У цих випадках розвести зразок 1: 1 0,9% розчином NaCl і повторити осадження.
Клініко-діагностичне значення ХС-ЛПЗЩ
Епідеміологічні дослідження показали зворотну залежність між рівнями ХС-ЛПЗЩ та поширеністю ІХС. Визначення ХС-ЛПЗЩ сприяє виявленню ризику розвитку ІХС.
Підвищенню рівня ХС-ЛПЗЩ сприяють такі захворювання, як первинний біліарний цироз, хронічний гепатит, алкоголізм, інші хронічні інтоксикації.