Методичні вказівки з лабораторної діагностики хламідійних інфекцій у тварин

1. Загальні положення

1.1. Лабораторні методи дослідження на хламідійні інфекції тварин включають: - виявлення специфічних антитіл у сироватці крові хворих тварин у РСК (РДСК) або ІФА; - виявлення хламідій та їх антигенів у патологічному матеріалі методом світлової чи люмінесцентної мікроскопії; - виділення хламідій на курячих ембріонах у культурі клітин або лабораторних тварин з подальшою їх ідентифікацією; - виявлення ДНК хламідій у патологічному матеріалі методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

1.2. До лабораторії для дослідження на хламідійні інфекції направляють: - сироватку крові в кількості 3-5 см від абортованих або підозрілих щодо захворювання тварин, а також у всіх випадках, передбачених чинною інструкцією. Кров від абортували тварин беруть двічі: у період клінічного прояву хвороби і повторно, від них, через 14-21 день. Сироватки направляють у лабораторію в кількості 1-2 см. Сироватки зберігають при температурі мінус 20°З досліджують одномоментно. Сироватки гемолізовані або контаміновані бактеріальною та грибковою флорою непридатні; - патологічний матеріал (зіскоби з кон'юнктиви, геніталій, фекалії) беруть тільки одноразовими або стерильними інструментами в одноразові пластикові пробірки з кришками або в стерильні пробірки (флакони) з гумовими пробками з фізрозчином у кількості 1 см і доставляють у ємності з льодом протягом 24 годин. Зберігати матеріал можна не більше 7 діб при 4 ° С та 10-12 міс при температурі мінус 20 ° С; - проби еякуляту або замороженої сперми, отримані від виробників, підозрілих на захворювання. Проби еякуляту направляють для дослідження в кількості 1 см;заморожену сперму в кількості не менше 2 гранул доставляють в лабораторію в контейнері з рідким азотом або пробірці з сухим льодом; - патологічний матеріал від загиблих або вбитих хворих тварин (шматочки паренхіматозних органів, лімфатичних вузлів та сім'яників), від абортованих тварин (шматочки плаценти); - абортовані плоди цілком або паренхіматозні органи та сичуг плода. Патологічний матеріал відбирають у стерильні флакони, що герметично закриваються, не пізніше двох годин після загибелі, забою тварини або аборту. Флакони з патматеріалом поміщають у термос з льодом, а абортовані плоди у вологонепроникну тару і в той же день, але не пізніше 24 годин, доставляють до лабораторії з дотриманням заходів, що виключають поширення збудника інфекції.

2. Серологічні дослідження

2.1. Серологічні дослідження на хламідійні інфекції засновані на виявленні специфічних антитіл у сироватці крові тварин у реакції зв'язування комплементу (РСК), реакції тривалого зв'язування комплементу (РДСК) і методом імуноферментного аналізу (ІФА), у тварин, що абортували, - на встановленні наростання титру антитіл в 4 разів. Тварин, вакцинованих проти хламідійного аборту, серологічно не досліджують протягом 1 року після вакцинації.

2.2. У РСК, РДСК використовують такі компоненти: - комплементзв'язуючий групоспецифічний хламідійний антиген; - контрольний антиген; - позитивну (імунну) сироватку крові овець, що містить групоспецифічні хламідійні антитіла; - негативну (негативну) сироватку крові овець; - комплемент (свіжа, консервована або ліофільно висушена сироватка крові морської свинки); - гемолізин (сироватка крові кролика,імунізованого еритроцитами барана); - еритроцити барана; - випробувані сироватки; - фізіологічний розчин, рН 7,0-7,2. Специфічний та контрольний антигени, позитивну та негативну сироватки виготовляють біофабрики, що випускають їх у спеціальних наборах. Антиген розводять у дистильованій воді та застосовують у РСК, РДСК у робочих титрах, зазначених на етикетці.

2.3. Гемолізин у РСК та РДСК використовують у подвоєному титрі (наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 його беруть 2:1000).

2.4. Еритроцити барана відмивають фізіологічним розчином шляхом центрифугування при 2500-3000 об/хв протягом 10-15 хв до повної прозорості надосадової рідини. Для РСК застосовують 2,5%-ну, для РДСК - 3%-ву завись еритроцитів з осаду. Перед роботою завись еритроцитів та гемолітичну сироватку в робочому розведенні змішують у рівних обсягах, отриману гемолітичну систему ставлять у термостат при 37°С на 20-30 хв для сенсибілізації. Під час роботи гемолітичну систему зберігають за кімнатної температури або в холодильнику при 2-4°С.

2.5. Для серологічного дослідження придатні лише свіжі випробувані сироватки. Допускаються до дослідження та одноразово заморожені, а також сироватки, консервовані борною кислотою (2% до об'єму) або мертіолятом (1:10000).

Мутні, пророслі або гемолізовані сироватки на дослідження непридатні.

2.6. Фізіологічний розчин для розведення компонентів (0,85% розчин хімічно чистого натрію хлориду в дистильованій воді, рН 7,2-7,4) готують і кип'ятять протягом 5 хвилин за день або в день постановки реакції.

2.7. Постановка реакції зв'язування комплементу (РЗК).

2.7.1. Реакцію ставлять об'ємом 1 см (по 0,2 см кожногокомпонента). Комплемент титрують щоразу перед постановкою головного досвіду на позитивній та 1-2 випробуваних сироватках.

2.7.2. Титрування комплементу. Сухий біофабричний комплемент розчиняють фізіологічним розчином до початкового обсягу, зазначеного на етикетці, і готують основне розведення 1:20. Кожну сироватку, розведену 1:5 (1 см сироватки + 4 см фізіологічного розчину) інактивують при 58-60°С 30 хв, розливають по 0,2 см у два ряди пробірок штатива Флоринського. Титрування комплементу починають з дози 0,02 см до 0,2 см з інтервалом по 0,02 см. Для цього в додатковий ряд пробірок вносять розведений комплемент 1:20 в десятикратному обсязі в дозах 0,2; 0,4; 0,6 і т.д. до 2,0 см і додають в кожну пробірку кількість фізіологічного розчину, що бракує до 2 см, тобто. 1,8; 1,6; 1,4 і т.д. Потім з першого розведення комплементу переносять по 0,2 см у перші пробірки всіх сироваток, другого розведення відповідно в другі і т.д. (Це можна виконувати апаратом Флоринського з мірними піпетками по 0,2 см). Перші ряди пробірок з позитивною і випробуваними сироватками (взято з досвіду) розливають специфічний антиген у робочому розведенні в антигенні ряди по 0,2 см, а в другі ряди - по 0,2 см фізрозчину. Пробірки струшують і ставлять водяну баню на 60 хв при 37-38°С. Потім у всі пробірки розливають гемолітичну систему по 0,4 см, струшують і ставлять у водяну баню на 20 хв при 37-38 ° С (схему титрування комплементу див. таблиці 1).

СХЕМА ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (ЗА ПЕРШОЮ РЯДУ ПРОБИРОК)