Мікроскопія - методи контрасту, Діаем

1. Світле поле

Метод світлого поля в світлі, що проходить, застосовується при дослідженні прозорих препаратів, у яких різні ділянки структури по-різному поглинають світло (тонкі пофарбовані зрізи тварин і рослинних тканин, тонкі шліфи мінералів та інші). Пучок променів з освітлювальної системи проходить препарат та об'єктив і дає рівномірно освітлене поле у площині зображення. Елементи структури препарату частково поглинають і відхиляють світло, що падає на них, що і обумовлює появу зображення.

Метод може бути корисний і при спостереженні об'єктів, що не погладжують, але тільки в тому випадку, якщо вони розсіюють освітлювальний пучок настільки сильно, що значна частина його не потрапляє в об'єктив. Метод світлого поля у відбитому світлі застосовується для спостереження непрозорих об'єктів, наприклад, травлених шліфів металів, біологічних тканин та різних мінералів. Висвітлення препарату проводиться зверху, через об'єктив, який одночасно виконує роль освітлювальної системи. Зображення, як і при проходить світлі, створюється за рахунок того, що різні ділянки препарату неоднаково відхиляють світло, що падає на них, а відбиті промені мають різну інтенсивність.

2. Темне поле

Темнопольна мікроскопія заснована на здатності мікроорганізмів сильно розсіювати світло. Для темнопольної мікроскопії користуються звичайними об'єктивами та спеціальними темнопольними конденсорами. Основна особливість темнопольних конденсорів полягає в тому, що центральна частина у них затемнена і прямі промені від освітлювача до об'єктиву мікроскопа не потрапляють. Об'єкт висвітлюється косими бічними променями й у об'єктив мікроскопа потрапляють лише промені, розсіяні частинками, які у препараті.Темнопольна мікроскопія заснована на ефекті Тіндаля, відомим прикладом якого є виявлення порошин у повітрі при освітленні їх вузьким променем сонячного світла. Щоб в об'єктив не потрапляли прямі промені від освітлювача, апертура об'єктива має бути меншою, ніж апертура конденсора. Для зменшення апертури звичайний об'єктив поміщають діафрагму або користуються спеціальними об'єктивами, забезпеченими ірисовою діафрагмою. При темнопольній мікроскопії мікроорганізми виглядають яскравими на чорному тлі. При цьому способі мікроскопії можуть бути виявлені мікроорганізми, розміри яких лежать за межами роздільної здатності мікроскопа. Проте темнопольна мікроскопія дозволяє побачити лише контури об'єкта, але з дає можливості вивчити внутрішню структуру. За допомогою темнопольної мікроскопії вивчають препарати типу розчавлена "крапля". Предметне скло повинно бути не товще 1,1-1,2 мм, покривне 0,17 мм, без подряпин і забруднень. При приготуванні препарату слід уникати наявності бульбашок і великих частинок (ці дефекти будуть видно яскравими і не дозволять спостерігати препарат). Для темнопольної застосовують потужніші освітлювачі та максимальне напруження лампи. Налаштування темнопольного освітлення в основному полягає в наступному: 1) встановлюють світло по Келеру; 2) замінюють світлопольний конденсор на темнопольний; 3) на верхню лінзу конденсора наносять імерсійну олію або дистильовану воду; 4) піднімають конденсор до зіткнення з нижньою поверхнею предметного скла; 5) об'єктив малого збільшення фокусують на препарат; 6) за допомогою центрувальних гвинтів переводять у центр поля зору світлу пляму (іноді має затемнену центральну ділянку); 7) піднімаючи та опускаючи конденсор, домагаються зникненнязатемненої центральної ділянки та отримання рівномірно освітленої світлої плями. Якщо цього зробити не вдається, то треба перевірити товщину предметного скла (зазвичай таке явище спостерігається при використанні занадто товстого предметного скла - конус світла фокусується в товщі скла). Після правильного налаштування світла встановлюють об'єктив потрібного збільшення та досліджують препарат.

3. Поляризація

Метод дослідження в поляризованих променях застосовується в проходить і у відбитому світлі для так званих анізотропних об'єктів, що володіють подвійним променем заломленням або відображенням. Такими об'єктами є багато мінерали, вугілля, деякі тваринні та рослинні тканини та клітини, штучні та природні волокна. При дослідженні анізотропних препаратів до нормальної схеми мікроскопа перед освітлювальною системою додають поляризатор, а після об'єктива - аналізатор, що у схрещеному чи паралельному становищі щодо друг друга. При схрещених поляризаторі та аналізаторі в темному полі зору мікроскопа видно темні, світлі або забарвлені анізотропні елементи об'єкта. Вигляд цих елементів залежить від положення об'єкта щодо площини поляризації та від величини подвійного променезаломлення. Точніше визначення оптичних даних об'єкта робиться за допомогою різних компенсаторів (нерухомих кристалічних пластинок, рухомих клинів і пластинок).

4. Фазовий контраст

При мікроскопії незабарвлених мікроорганізмів, що відрізняються від навколишнього середовища лише за показником заломлення, зміни інтенсивності світла (амплітуди) не відбувається, а змінюється лише фаза минулих світлових хвиль. Тому око цих змін помітити не може і об'єкти, що спостерігаються, виглядають малоконтрастними, прозорими. Для спостереження таких об'єктів використовують фазово-контрастну мікроскопію, засновану на перетворенні невидимих фазових змін, що вносяться об'єктом, на амплітудні, помітні оком. Фазово-контрастний пристрій може бути встановлений на будь-якому світловому мікроскопі і складається з: 1) набору об'єктивів зі спеціальними фазовими пластинками; 2) конденсора з диском, що повертається. У ньому встановлені кільцеві діафрагми, що відповідають фазовим платівкам у кожному з об'єктивів; 3) допоміжного телескопа для налаштування фазового розмаїття. Налаштування фазового розмаїття полягає в наступному: 1) замінюють об'єктиви і конденсор мікроскопа на фазові (позначені літерами Ph); 2) встановлюють об'єктив малого збільшення. Отвір у диску конденсора повинен бути без кільцевої діафрагми (позначеною цифрою "0"); 3) налаштовують світло за Келером; 4) вибирають фазовий об'єктив відповідного збільшення та фокусують його на препарат; 5) повертають диск конденсора і встановлюють відповідну об'єктиву кільцеву діафрагму; 6) виймають з тубуса окуляр і вставляють на його місце допоміжний телескоп. Налаштовують його так, щоб були різко видні фазова пластинка (у вигляді темного кільця) та кільцева діафрагма (у вигляді світлого кільця того ж діаметра). За допомогою регулювальних гвинтів на конденсорі поєднують ці кільця. Виймають допоміжний телескоп і встановлюють окуляр. Завдяки застосуванню цього способу мікроскопії контраст живих незабарвлених мікроорганізмів різко збільшується і вони виглядають темними на світлому фоні (позитивний фазовий контраст) або світлими на темному тлі (негативний фазовий контраст). Фазово-контрастна мікроскопія застосовується також для вивчення клітин культури тканини, спостереження дії різних вірусів наклітини і т. п. У цих випадках часто застосовують біологічні мікроскопи із зворотним розташуванням оптики – інвертовані мікроскопи. У таких мікроскопів об'єктиви розташовані знизу, а конденсор зверху.

5. Флуоресценція (люмінесценція)

6. Хоффманівський контраст Хофффановський контраст (ХК) є методом косого освітлення, що підвищує контраст в забарвлених і незабарвлених препаратах за рахунок утворення градієнта оптичних фаз. ХК дозволяє спостерігати тривимірне зображення живих зразків у пластикових чашках з високою чіткістю, що дає розширені можливості для aдaч. За рахунок використання великих робочих відстаней і високих чисельних аппарат метод дозволяє точно відстежувати рух в полі зору, наприклад, при проведенні мікроманіпуляцій.

Інші дослідження - такі, як електрофізіологія, допоміжні репродуктивні технології та ЕКЗ - вимагають не тільки конденсорів, але і об'єктів з великим робочим місцем. При дослідженні товстих зразків ХК допомагає вирішити задачу повного вивчення зразка шляхом вибору послідовності фокальних планів. При цьому кожен верхній фокальний план не несе інформації про нижньолежачий план. ХК може бути застосований на мікроскопі з флуоцентним освітлювачем. Вивчення морфології з застосуванням флуоресценції або без такої можливо без зміни об'єктивів і зразка. Варто відзначити перевагу Хоффманівського розмаїття в порівнянні з Фазовим контрастом. Відомо, що Фазовому контрасту присутній ефект Гало - поява ореолу, що світиться, по контуру зображення об'єкта. У результаті Ви можете втратити важливу інформацію. XК не дає Гало, що дозволяє легко визначати властивості кроєвих структур, наприклад, точно заміряти кути або відстані.

7. ДІК (диференціально-інтерференційний контраст)

ДІК (диференціально-інтерференційний контраст) – є чудовим механізмом для створення контрасту у прозорих препаратах. Мікроскопія з ДІК є інтерференційною системою з розщепленням пучка світла, при якій контрольний пучок відхиляється на невелику відстань, зазвичай меншу, ніж діаметр дифракційного кружка. За допомогою даного методу виходить монохроматичне відтінене зображення, яке відображає градієнт оптичних шляхів як високо-, так і низько-просторових частот, присутніх в препараті. Ті ділянки препарату, при проходженні через які оптичні шляхи подовжуються по відношенню до контрольного пучка, виглядають яскравіше або темніше, тоді як ділянки, між якими відмінності менші, мають протилежний контрастом. Чим крутішим стає градієнт оптичних пучків, тим різкіше контраст зображення