МІОГЛОБІН І МИТОХОНДРІЇ ОКСІМІОГЛОБІН У ПРОЦЕСІ ДЕЗОКСИГЕНАЦІЇ ВЗАЄМОДІЄ З МІТОХОНДРІАЛЬНОЮ
Ціна:
Автори роботи:
Науковий журнал:
Рік виходу:
Текст наукової статті на тему «МІОГЛОБІН І МІТОХОНДРІЇ: ОКСІМІОГЛОБІН У ПРОЦЕСІ ДЕЗОКСИГЕНАЦІЇ ВЗАЄМОДІЄ З МІТОХОНДРІАЛЬНОЮ МЕМБРАНОЮ»
БІОХІМІЯ, 2009, тому 74, вип. 11, с. 1488 – 1497
МІОГЛОБІН І МІТОХОНДРІЇ: ОКСІМІОГЛОБІН У ПРОЦЕСІ ДЕЗОКСИГЕНАЦІЇ ВЗАЄМОДІЄ З МІТОХОНДРІАЛЬНОЮ МЕМБРАНОЮ
Вступила до редакції 28.04.08 Після доопрацювання 10.04.09
У стандартних умовах полярографічно вимірювані швидкості споживання O2 мітохондріями (МХ) з печінки щура, нативними, роз'єднаними за допомогою FCCP та свіжозамороженими, як без оксиміо-глобіну (V0), так і в присутності 0,11-0,25 мМ розчину MbO2 кашалоту ( К1). У тих же умовах спектрофотометрично реєструвалася швидкість дезоксигенації MbO2 у присутності МХ (V2). Для свіжозаморожених МХ при рН 5,6-7,6 досліджено залежність V1 та V2 від заряду міоглобіну, а при рН 7,4 вивчено вплив на V1 та V2 ряду інших різнозаряджених білків - апо-Mb, лактальбуміну, яєчного лізоциму та БСА. Знайдено, що у присутності MbO2 швидкість дихання нативних і заморожених МХ прискорюється на 10—30% (Vj > V0), але ефект відсутня у разі МХ, роз'єднаних FCCP, тобто. MbO2 не впливає на максимальну швидкість споживання O2. Швидкість дезоксигенації MbO2 у присутності різних препаратів МХ повністю збігається зі швидкістю споживання ними O2 (V2/V1
1 при рН 72-75). Значення V2/V1 зростають при pH 13 мм Hg цей внесок виявляється дуже малим, а при менших значеннях PO2 становить всього 1,5-4% [12, 15]. Розрахунки з використанням знайденого недавно для серця миші [16] значення DMb, яке приблизно в 3 рази вище значення DMb для скелетних м'язів, проте показують, що навіть приPO2 = 1,8 мм Hg та 0,2 мМ концентрації МbO2 вклади вільного кисню та O2, пов'язаного з міоглобіном, однакові.
Таким чином, ефективне функціонування Mb за механізмами «депо кисню» та «полегшеної дифузії» є досить проблематичним. Обидва механізми не припускають будь-якої взаємодії білка з клітинними структурами.
рамами або метаболітами (формулюються в рамках гомогенної термодинаміки та кінетики), так що спорідненість міоглобіну до 02 у всіх модельних розрахунках приймається постійним. Розуміння ж справжнього механізму функціонування МЬ у клітині та її ролі у доставці 02 до МХ як важливо для вирішення фундаментальної проблеми молекулярної біології та біохімії, але дуже актуально й у прикладному аспекті. При конструюванні установок для вирощування клітинних культур треба створити найкращі умови постачання їх 02. Відповідно, при математичному моделюванні цих процесів треба правильно оцінити внесок МЬ та необхідність введення в культуру генів та клітин, здатних його експресувати [17].
Раніше нами було показано [18], що відщеплення 02 від МЬ02 при фізіологічних значеннях Р02 можливе лише за безпосереднього контакту білка з мітохондріями. Якщо ж дихаючі МХ відокремлені від розчину МЬ02 напівпроникною мембраною, то навіть при близькій до нуля концентрації 02 ніякої дезоксигенації МЬ02 не спостерігається. Таким чином, процес дезоксигенації МЬ02 в клітині повинен включати активну взаємодію білка з мітохондріальною мембраною, результатом якого повинно бути зменшення його спорідненості до ліганду.
Мета цієї роботи — вивчення характеру цієї взаємодії. Так як зовнішня мембрана мітохондрій заряджена негативно і 50% її поверхні зайнято білками, досліджено вплив на швидкість дезоксигенації МЬ02 (К2), що вимірюєтьсяспектрофотометрично, сумарного заряду міоглобіну кашалоту (р1 8,3) та хімічно модифікованого СМ-МЬ02 (р1 5,2), карбоксиметильованого за гістидинами, при рН 5,6-7,6. Для оцінки ролі електростатичних взаємодій у системі вивчено також швидкість дезоксигенації МЬ02 у присутності інших білків, негативно заряджених мономерного лактальбуміну (р1 4,4) та тетрамерного БСА (р1 4,7) та позитивно зарядженого яєчного лізоциму (р1 11). Для тестування мембрани МХ на наявність будь-яких специфічних до міоглобіну білків, каналів або ділянок фосфоліпідів було вивчено також вплив на У2 апоміоглобіну, структурно гомологічного холобілку, але не зв'язуючого 02. Крім того, полярографічно були вимірювані швидкості споживання 02 з розчину мітохондрії , нативними, роз'єднаними за допомогою БССР і свіжозамороженими в різних умовах, без оксиміоглобіну (0) і в присутності 0,11-0,25 мМ розчину МЬ02 кашалоту і різних білків (У1).
Матеріали. Мітохондрії з печінки щури виділяли стандартним методом за допомогою диференціального центрифугування в середовищі, що містила 220 мМ маніту, 70 мМ сахарози, 5 мМ Hepes, 1 мМ ЕГТА, рН 7,4. Кінцеве центрифугування проводили при 3000 g протягом 15 хв (осідали лише великі неруйновані МХ). Використовували свіжовиділені нативні сполучені МХ з мінімальною швидкістю сукцинатного дихання (Vmin), швидко заморожені при -18° і одноразово відтані МХ, а також нативні МХ, роз'єднані за допомогою FCCP (0,5 мкМ), з максимальною швидкістю сукцинатного дихання (Vmax ); Vmax/V. = 4 5-6 5
Метміоглобін (мет-Mb) із скелетних м'язів кашалоту (17,8 кДа, фракція IV) отримували та очищали, як описано раніше [19]. Оксиміогло-бін (окси-Mb) отримували в аеробних умовах відновленням мет-Mb дитіонітом натрію, якийпотім відокремлювали гель-фільтрацією на колонці з сефадекс G-25.
Карбоксиметильований за залишками гіс-тидину мет-Mb кашалоту (CM-Mb) отримували за допомогою 0,2 М натрію бромацетату. Реакцію проводили 0,1
Для подальшого читання статті необхідно придбати повний текст. Статті надсилаються у форматіPDFна вказану при оплаті пошту. Термін доставки становитьменше 10 хвилин. Вартість однієї статті -150 рублів.
Подібні наукові роботи на тему «Хімія»
ПОСТНІКОВА Г.Б., ШЕХОВЦОВА О.О. - 2012 р.
ГРИГОРІВ П.А., ПОCТНІКОВА Г.Б., ШЕXОВЦОВА О.О. - 2012 р.