Молекулярно-генетичні методи
Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики) - це велика та різноманітна група методів, призначена для виявлення варіацій у структурі досліджуваної ділянки ДНК. ДНК-методи використовуються в наступних напрямках:
1. Для діагностики моногенних та мультифакторіальних спадкових хвороб.
2. Для пренатальної діагностики моногенних хвороб чи статі плода (у разі Х – зчепленого успадкування).
3. У судовій медицині для ідентифікації особистості (геномна дактилоскопія) та встановлення спорідненості.
4. Для діагностики інфекційних захворювань.
5. Для діагностики онкологічних захворювань.
Можливості діагностики пов'язані із здійсненням програми «Геном людини». Перелік моногенних хвороб, що діагностуються молекулярними методами, та доступних пренатальній діагностиці: муковісцидоз, м'язова дистрофія Дюшенна-Беккера, гемофілія (А та В), фенілкетонурія, хвороба Хантера (мукополісахаридоз), адрено – генітальний синдром, Хере ін.
1993 року таких захворювань було 130, 1994 року – 600, зараз ще більше. Наразі можлива діагностика будь-якого спадкового захворювання, ген якого картований та доступний прямій чи непрямій діагностиці.
У перспективі можна буде говорити про «генетичний паспорт новонароджених», тобто про те, що вже незабаром після народжень за допомогою автоматизованої системи вдасться проаналізувати весь спектор найпоширеніших захворювань як моногенних, так і мультифакторіальних.
Молекулярно-генетичні методи можна розділитина прямі та непрямі.
Пряма діагностика проводиться у тих випадках, коли будова гена вжевивчено. Вона включає секвенування ДНК, реєстрацію зміни електрофоретичної рухливості мутантних молекул ДНК, трансляцію білкового продукту in vitro та ін. перебувають поруч із геном – визначення поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів та інших.
Розглянемо деякі з них.
Секвенування ДНК -це найбільш точний метод, оскільки дозволяє визначити будову гена та виявити будь-яку мутацію. Методики секвенування дуже трудомісткі, вимагають значних витрат матеріалів і часу, у зв'язку з чим знайшли широкого застосування у клінічної генетиці, а застосовуються головним чином розшифровки геному людини.
З відкриттям на початку 70-х років рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз) - ферментів, здатних розрізати нитки ДНК у строго певних ділянках - сайтах рестрикції, дослідники отримали можливість виділяти дрібніші і в той же час стабільні за довжиною та легше ідентифіковані фрагменти.Визначення поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ)(RFLP – restriction fragments length polymorphism) один із поширених методів ДНК-діагностики. Принцип методу: виділена ДНК обробляється ферментами, які «розрізають» її на фрагменти в певних ділянках (сайтах рестрикції). Патологічні мутації можуть змінювати сайти рестрикції, що призводить до зміни довжин отриманих фрагментів.
Дещо пізніше широкий розвиток отримали різні способи вивчення послідовностей ДНК за допомогою олігонуклеотидних зондів - штучно синтезованих коротких ланцюгів нуклеотидів, мічених радіоактивними мітками. За певних умов зазначені зонди можутьспецифічно зв'язуватися (гібридизуватися) з комплементарними послідовностями в аналізованій ДНК, що свідчить про присутність шуканого фрагмента.
Виділення ДНК для дослідження зазначеними методами є досить трудомісткою процедурою. По-перше, ДНК у клітинах міститься у відносно невеликих кількостях порівняно з іншими речовинами, тому для отримання очищених препаратів потрібні складні та дорогі методи. По-друге, молекули ДНК, особливо еукаріотів, мають значну довжину і є досить тендітним ланцюгом, який при різних біохімічних маніпуляціях виявляється так чи інакше пошкодженим.
Для виділення ДНК одержаний біологічний матеріал обробляють протеолитическими ферментами, щоб видалити всі білки. ДНК адсорбують на пористих носіях або екстрагують органічними розчинниками, після чого слід багаторазове очищення. При цьому одержують всю ДНК клітин (геномну ДНК).
Дослідника зазвичай цікавить лише певна, специфічна ділянка ДНК, яка важко ідентифікується серед багатьох інших, у тому числі нетранскрибованих ДНК-послідовностей. Це завдання вирішувалося за допомогою трудомісткого підходу – шляхом клонування фрагментів ДНК (тобто розмноження) у різних організмах (т.зв. векторах), найчастіше у фагах (вірусах бактерій) або у позахромосомних спадкових одиницях – плазмідах. При цьому цікавий фрагмент молекули ДНК будь-якого організму спочатку вбудовувався в геном фага або в кільцеву ДНК плазміди за допомогою спеціальних ферментів - рестриктаз, нуклеаз, полімераз і лігаз, після чого відбувалося зараження бактерій фагом (трансдукція) або внесення плазмідної ДНК в цит трансформація). Розмноження бактерій цим вело до накопиченнядосить великих кількостей цікавлять дослідника фрагментів ДНК.
Однак процедури молекулярного клонування дуже трудомісткі, вимагають роботи з радіоактивними речовинами, високого ступеня очищення ДНК, тому вони практично не вийшли за межі великих спеціалізованих лабораторій, хоча необхідність дослідження ДНК на рівні нуклеотидних послідовностей давно стала потребою практичної охорони здоров'я.
Зазначені труднощі були подолані з відкриттям в 1983 р. К.Б.Мюллісом (США) методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який знайшов широке застосування в різних галузях практичної медицини.