Морфологічне тестування HER2-статусу при раку молочної залози, Завалишина Л
*Імпакт фактор за 2017 р. за даними РІНЦ
Журнал входить до Переліку наукових видань ВАК, що рецензуються.
Читайте у новому номері
Сучасна морфологічна діагностика пухлин вимагає не тільки верифікації гістологічного варіанту та ступеня диференціювання новоутворення, а й обов'язкової оцінки прогнозу перебігу хвороби та передбачення відповіді на терапію. Щодо цього надзвичайно важливі імуногістохімічний профіль раку, його морфофункціональна характеристика.
В даний час для вибору оптимальної лікувальної тактики, вибору адекватного лікарського лікування (антіестрогени, антроциклінові антибіотики, герцептин тощо) слід встановити не тільки стадію раку (включаючи систему TNM), гістологічний варіант та ступінь злоякісності, а й обов'язково – фенотип. При раку молочної залози найбільш важливими прогностичними показниками є проліферативна активність, експресія естрогенів та прогестеронів та, безумовно, експресія білка HER2/neu (c-erbB-2). Остання характеристика, за даними багатьох дослідників, не лише дозволяє оцінити прогноз хвороби, особливо за наявності метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах, а й, що особливо важливо, включити до лікувального комплексу новий патогенетичний препарат «Герцептин» (транстузамаб) – високоефективний препарат спрямованої дії 2,6]. Цей препарат є рекомбінантним гуманізованим моноклональним антитілом, що зв'язується з рецептором HER2/neu на поверхні пухлинних клітин. Висока ефективність Герцептину обумовлена лише імуноопосередкованою цитотоксичністю, а й безпосереднім блокуванням проліферації, стимуляцією апоптозу, антиангіогенною активністю [3,5]. HER2/neu – тирозинкіназний трансмембранний рецептор із сімейства ERBB, що складається з чотирьох функціонально пов'язаних рецепторних молекул, що відіграють важливу роль у клітинному диференціюванні, проліферації, апоптозі. Під дією лігандів HER2/neu утворює гетеродимери з іншими рецепторами даного сімейства та регулює роботу відповідних сигнальних каскадів [3,6]. HER2/neu експресується у невеликій кількості та в клітинах нормальних тканин. Однак у процесі злоякісного зростання відбувається його гіперекспресія та/або ампліфікація кодуючого його гена, що доводиться лише спеціальними методами дослідження. Встановлено, що онкопротеїн c–erbB–2 суперекспресовано у 20–30% випадків інвазивного раку молочної залози [7]. Проте для використання Герцептину необхідно достовірно підтвердити наявність гіперекспресії або ампліфікації цього гена у кожної конкретної хворої, оскільки в іншому випадку застосування дорогого препарату виявляється марним. Основним методом визначення гіперекспресії HER2/neu в даний час є імуногістохімічний. Проведення імуногістохімічних досліджень висуває високі вимоги до відділення патологічної анатомії. Необхідно мати обладнання (провідні апарати, станції заливки, мікротоми високого класу та ін.), що дозволяє отримувати якісний вихідний матеріал і виготовляти тонкі парафінові зрізи, придатні для імуногістохімічного дослідження. Неякісний вихідний матеріал і неправильна постановка імуногістохімічних реакцій ведуть до неправильної оцінки результатів і тим самим до неадекватного призначення або непризначення препарату. Імуногістохімічне дослідження проводиться на біопсійному та операційному матеріалі, фіксованому 10%-м нейтральним формаліном, забуференимфосфатним буфером протягом 24 годин. Адекватність фіксації та проведення матеріалу є найважливішим фактором отримання достовірного результату імуногістохімічного дослідження. Гістологічне проведення матеріалу може здійснюватися в ручному або автоматичному режимі з використанням провідних апаратів. Після гістологічного проведення матеріал заливається в парафін і потім готуються зрізи товщиною 4 мкм. Зрізи монтуються на спеціальне високоадгезивне скло (Polysine, Histobond, Sialinised Slaid DAKO) і висушуються протягом 18 годин при температурі 37°С. Проведення дослідження на цитологічному матеріалі заборонена, т.к. кількості матеріалу недостатньо для правильної оцінки. Слід наголосити, що оцінка результатів проводиться тільки в інвазивному раку, т.к. структури раку in situ, незважаючи на виражену гіперекспресію білка, не підлягають обліку. Бажано використовувати на гістологічний матеріал пухлини, які не піддані передопераційній променевій та/або хіміотерапії, тому при плануванні лікування з передопераційною терапією необхідна товстоїгла трепанобіопсія та проведення імуногістохімічного дослідження на цьому матеріалі. У разі відсутності матеріалу первинної пухлини можлива оцінка гіперекспресії метастатичних лімфатичних вузлах, т.к. у метастазах герцепт-статус пухлини зазвичай зберігається. Імуногістохімічне дослідження (ІГХ) в ручному режимі або з використанням імуногістостейнера рекомендується проводити з набором реактивів, готових до вживання - DAKO HerceptTest. Можливе також застосування концентрованих антитіл до білка HER2/neu (c-erbB2) та детекційної системи EnVision (DAKO). Для ІГХ визначення гіперекспресії HER2/neu при використанні антитіл як у робочому розведенні, так і концентрованих антитіл,необхідним етапом є демаскування антигену. Відновлення антигенної активності за допомогою набору HercepTest проводиться у водяній бані, в розчині Epitope Retrieval Solution (DAKO), pH 6,0 при температурі 95-99°С. Депарафіновані та регідратовані зрізи занурюють у чашку Копліна з підігрітим буфером, поміщають у водяну баню при температурі 95–99°С та інкубують протягом 40 хв. Потім остуджують скло в буфері до кімнатної температури протягом 20 хв. і промивають буфером для промивання 2 хв. Демаскування антитіл можна також проводити у спеціалізованому міні-автоклаві Retrival 2000 (Pick Cell) або у спеціальній каструлі під тиском (DAKO) відповідно до інструкції до цих приладів протягом 20 хв. при температурі 121 ° С або в мікрохвильовій печі – 20 хв. при потужності 500-750 W. Після демаскування антигену приступають безпосередньо до постановки ІГХ реакції, детально описаної в ряді методичних рекомендацій [1,7]. Стандартизація підготовки матеріалу та самого імуногістохімічного дослідження стає найважливішим фактором, що визначає достовірність отриманого результату та адекватність призначення або непризначення препарату. При використанні для дослідження концентрованих антитіл застосовується та сама методика, тільки попередньо готується робоче розведення первинних антитіл із застосуванням спеціального розріджувача антитіл (DAKO). Дослідження завжди проводиться з обов'язковим використанням контрольного скла з уже відомим результатом для контролю правильності реакції та якості реагентів. При оцінці результатів реакції враховується експресія лише в інвазивному компоненті пухлини. Оцінка результатів реакції проводиться за допомогою бальної шкали оцінки – 0, 1+, 2+, 3+, розробленої виробником тесту та схваленої FDA. 0 – приповній відсутності продукту реакції або виявленні його на мембранах менш ніж 10% клітин пухлини (рис. 1), 1+ – при незначній кількості продукту реакції на частини мембрани більш ніж 10% клітин пухлини (рис. 2), 2+ – при помірній кількості продукту реакції на мембранах більш ніж 10% клітин пухлини (рис. 3), 3+ – за наявності яскраво вираженого продукту реакції протягом усієї мембрани клітини при фарбуванні більш ніж 10% клітин пухлини (рис. 4). Оцінка проводиться з використанням світлового мікроскопа, в основному при збільшенні об'єктиву 10х і лише в прикордонних випадках 1+/2+ - об'єктиву 20х. Якщо ми відзначаємо реакцію більш ніж 10% клітин зі збільшенням 20х, такий результат оцінюється як 1+. Враховується тільки мембранне фарбування, і ніколи не береться до уваги наявність забарвленої цитоплазми. Цитоплазматичне фарбування може бути пов'язане як з помилками у підготовці матеріалу або постановки реакції, так і порушенням процесів транспорту та формування рецепторів на клітинній мембрані пухлинної клітини. Хоча в цьому випадку наявність цитоплазматичної реакції становить безперечний науковий інтерес для призначення лікування герцептином, ця реакція не повинна враховуватися. Герцепт-статус, оцінений як 0 і 1+, слід вважати негативним, тобто. гіперекспресія білка та ампліфікація гена Her-2 відсутні. Герцепт-статус, оцінений як 3+, є позитивним, тобто. гіперекспресія білка та ампліфікація гена є. При герцепт-статусі 2+ за експресією білка на підставі імуногістохімічної реакції не можна впевнено судити про ампліфікацію гена, тому потрібне дослідження, що прямо виявляє наявність або відсутність ампліфікації. Таким методом є гібридизація in situ: при використанні флуоресцентної мітки – FISH (флуоресцентна in situ)гібридизація) та при використанні хромогенної мітки – СІШ (хромогенна in situ гібридизація) [4]. Обидва методи виконуються на зрізах з того ж зразка (блоку), на якому проводилося імуногістохімічне дослідження. Ці методи також чутливі до умов фіксації та проведення матеріалу. При використанні FISH методу потрібно спеціалізоване дороге обладнання та набори реагентів, що випускаються фірмами Dako та Vysis. Оцінка наявності ампліфікації гена HER2/neu проводиться шляхом підрахунку сигналів, якими позначено центромірну ділянку хромосоми 17, і сигналів, що мітять ген HER/neu. Якщо їхнє співвідношення більше 2, це свідчить про наявність ампліфікації (рис. 5,6). При використанні методу CISH (тест-набір фірми Zymed) використовується зонд тільки до гена HER2/neu і проводиться підрахунок сигналів, що мітять лише кількість копій ампліфікованого гена. При кількості сигналів більш як 6 результат оцінюється як позитивний (рис. 7). При прикордонних станах (3-5 сигналів) застосовується додатково ще й FISH метод, що дозволяє визначити кількість хромосом, оскільки в пухлинних клітинах можлива як анеуплоїдія, так і поліплоїдія. Таким чином, для ефективного призначення Герцептину хворим на рак молочної залози необхідне визначення герцепт-статусу пухлини імуногістохімічним методом та застосування методів in situ гібридизації за наявності статусу 2+. Використання цих методів потребує відповідного оснащення патологоанатомічних відділень та навчання лікарів-патологоанатомів методикою проведення та оцінки результатів дослідження. Імуногістохімічне визначення герцепт-статусу можливе тільки у великих сертифікованих онкологічних установах, а застосування методів in situ гібридизації - тільки в регіональних центрах. Автори висловлюють подякуПредставництву та фармацевтичній компанії Hoffmann – La Roche в Україні за допомогу у проведенні цієї роботи.