Основи імуногістохімічних досліджень

Імуногістоцитохімія – метод ідентифікації та визначення локалізації в клітині та тканинах різних структур, що мають антигенні властивості, заснований на реакції антиген-антитіло. Імуногістоцитохімія є високотехнологічним методичним доповненням до традиційних гістологічним методам дослідження у клінічній діагностиці. Оскільки в даний час стала доступною велика кількість полі-і моноклональних антитіл, що мають високу специфічність і авидність, кількість прикладних завдань, для вирішення яких можуть використовуватися методи ІГХ, стала практично необмеженою.

Ці методи широко використовуються для:

  • диференціальної діагностики пухлин, визначення джерела метастазу при неясному вогнищі пухлини, оцінки гормонального статусу пухлини, імунофенотипування пухлин, наприклад пухлин лімфоїдної системи, визначення факторів прогнозу пухлинного процесу;
  • ідентифікації різних мікроорганізмів (бактерій, вірусів);
  • визначення гормонів та його рецепторів тощо.

Принцип методу

Основою ІГХ-методу є імунологічна реакція антигену та антитіла. ІГХ-методи дозволяють локалізувати та ідентифікувати клітинні та тканинні антигени, ґрунтуючись на їх зв'язуванні з антитілами.

Використання антитіл лежить в основі досліджень різних молекулярних утворень: структурних компонентів клітини; • рецепторів клітинної поверхні; • клітинних продуктів (гормонів, ферментів, імуноглобулінів).

Для візуалізації місця зв'язування антигену з антитілом використовується цілий ряд міток: • флуоресцентні барвники; • ферментні мітки; • метали; • металопротеїни; • радіоізотопи.

Моноклональні антитіла отримують методом гібридомної технології. Незважаючи на те, що їх отримання багатоетапне і складне, вони є високоспецифічними і високоавидними антитілами і спрямовані до одного епітопу антигену.

Поліклональні антисироватки, одержувані при імунізації тварин, містять АТ до різних епітопів антигену (АГ). Для отримання поліклональної антисироватки лабораторній тварині вводять очищену артеріальну гіпертензію разом з неспецифічним стимулятором імунної відповіді - ад'ювантом. АГ стимулює безліч В-лімфоцитів, кожен з яких дає клон плазматичних клітин, що продукує АТ. АГ може мати кілька епітопів і антисироватка містить імуноглобуліни проти кожного з них, причому кожен клон плазматичних клітин здатний виробляти АТ лише до одного типу епітопів.

Первинні концентровані антитіла за допомогою розчину розведення (Antibody Diluent) розводяться до робочої концентрації. Максимальні межі розведення кожного антитіла рекомендовані виробником. Система візуалізації включає вторинні антитіла, кон'юговані з ферментом.

Існує кілька варіантів постановки ІГЦХ методу, що найчастіше використовуються:

  • прямий імунофлюоресцентний (ІФ),
  • непрямий пероксидазний.

Спочатку, візуалізація тканинних антигенів імуноферментними способами фарбування проводилася прямим методом, що використовує ферменти, безпосередньо кон'юговані з антитілами відомої антигенної специфічності. Цей метод дозволяє використовувати світловий мікроскоп, але є низькочутливим. Чутливість імуногістохімічного фарбування була значно підвищена з розвитком непрямого способу, в якому мічені ферментом вторинні антитіла зв'язуються з первиннимиантитілами, з'єднаними з антигеном. Згодом з'явилися триетапні методи, такі як пероксидазно-антипероксидазний метод, авідин-біотиновий комплекс та інші.

Сучасні системи візуалізації комплексу антиген-антитіло відносяться до нового покоління фермент-опосередкованих методів фарбування та дозволяють проводити імунологічні дослідження з високою специфічністю та чутливістю за наявності лише світлового мікроскопа. Це робить доступним сучасні методи досліджень навіть для лабораторій, не оснащених спеціальним обладнанням.

Системи візуалізації мають ряд переваг у порівнянні з традиційними фермент-опосередкованими методами:

  • надають можливість оцінити імунологічний профіль і морфологічні особливості клітини одному препараті (при цьому досліджуваний матеріал може бути фіксований різними методами і допускає тривале зберігання);
  • забезпечують високу чутливість і специфічність імуногістохімічних досліджень (наприклад, чутливість стрептавідин-біотинового методу системи візуалізації LSAB (виробництва DAKO) у 8 разів перевищує чутливість авідин-біотинового комплексу, а чутливість системи CSA (виробництва DAKO) порівнянна з методами молекул метод гібридизації in situ);
  • значно скорочують час аналізу та спрощують процедуру, тим самим дозволяючи одночасно обробляти велику кількість зразків;
  • дозволяють виявляти антигени із слабкою експресією;
  • система подвійного фарбування дозволяє одночасно виявляти два різні антигени на одному препараті.

Поява системи візуалізації EnVision (виробництва DAKO) стала революційним моментом в історії імуногістохімії і стала початкому розвиток цілої серії систем, мають у своїй основі декстрановую технологію. Всі типи систем візуалізації для світлового мікроскопа застосовні для використання широкої гами первинних специфічних антитіл, що пропонуються у різноманітності виробниками.

Така універсальність систем дозволяє використовувати їх у: • імунофенотипуванні клітин крові та тканин; • оцінки їхнього функціонального стану; • діагностики патологічних змін, у тому числі онкологічних та виявлення інфекційного ураження клітин.

Системи візуалізації можуть бути використані для досліджень на парафінових зрізах, мазках, кріосрізах, відбитках та препаратах, отриманих центрифугуванням клітинних суспензій. Можливість вибору субстрату дозволяє отримувати різне фарбування препаратів.

Вимоги до обладнання.

Для отримання гістологічних препаратів з метою проведення ІГХ-досліджень необхідне традиційне гістологічне обладнання, що дозволяє отримувати якісні мікропрепарати: апарат гістологічного проведення матеріалу, апарат для заливання парафінових блоків, мікротом, мікроскоп.

Додаткове обладнання для методу ІГГ. ІГГ-методи відносяться до ручних напівкількісних мікрометодів, що визначає відповідний набір додаткового обладнання, необхідний для проведення методу.

А саме: 1. Батарея ємностей для депарафінізації та регідратації (ємності для фарбування) близько 12 шт. 2. Скляний посуд (колби для буферів, склянки, циліндри, ємності, пляшки) 3. Контейнер з тримачем термічно та хімічно стійкий для термічної обробки матеріалу для проїдання демаскування антигену. 4. Устаткування для термічної обробки:

  • баня для ІГХ (до 100 град С, прецизійна)
  • мікрохвильова піч (побутова, потужність щонайменше 800 Вт)
  • електроплитка (побутова)
  • скороварка (побутова)

5. піпеткові дозатори з набором наконечників

  • малого обсягу 0,5 – 10 мкл
  • середнього 1-50, 20-200
  • великого до 1000 мкл, до 5000 мкл

6. Гідрофобний олівець для ІГХ 7. Терези (для самостійного приготування наважок солей для буферів) 8. рН-метр (для контролю рН приготовлених буферів) 9.Холодильник для зберігання специфічних реактивів та буферів (побутовий) 10. Термостат

Облік результатів дослідження.

Для обліку результатів ІГГ-дослідження необхіднийсвітловий мікроскоп відповідного класу. Системи архівації та аналізу зображення, що складаються зі світлового мікроскопа, цифрової фотокамери та комп'ютера, дозволяють зберігати зображення отриманих мікропрепаратів в оцифрованому вигляді та піддавати його різним методам морфоаналізу за допомогою спеціалізованих програм.

Тест-реагенти для проведення ІГХ-методу. Вільні та кон'юговані антитіла, системи візуалізації (вторинні антитіла) длясвітлового мікроскопа, додаткові реагенти, контрольні матеріали, виробництва:

  • DAKO (Данія)
  • NOVOCASTRA LABORATORIES (Велика Британія)
  • ABCAM (Велика Британія)
  • CHEMICON (США)
  • PHARMINGEN (США)
  • SIGMA