Основи сучасної імунодіагностики, Medis CoM
ТОВ "Медіс КоМ", лікар-консультант О.І. Вострикова, 2003Традиційні методи клініко-імунологічних досліджень поділяють на методи оцінки клітинного та гуморального імунітету. У сучасній практиці клініко-імунологічних досліджень основним об'єктом аналізу є кров – як її клітинні компоненти, так і сироватка. В даний час у полі уваги імунологів поряд з мононуклеарною фракцією все частіше виявляється фракція гранулоцитів. Сьогодні імунологи практично повністю відмовилися від методів, заснованих на розеткоутворенні. Це були перші методи, які дозволили визначати Т-і В-лімфоцити людини в період, коли були відсутні антитіла для виявлення цих клітин. Число недоліків у цих методів досить велике: неоднозначність трактування результатів (вони залежать від умов постановки реакції, якості реагентів, визначаються станом не тільки маркерних молекул, а й цитоскелета та ін), труднощі, пов'язані з їхньою стандартизацією та автоматизацією. Проблему визначення субпопуляцій вдалося вирішити після впровадження проточної цитофлуориметрії та появою широкого спектра моноклональних антитіл до маркерних молекул імуноцитів. Цитофлуориметричний аналіз може бути представлений таким чином: Клітини обробляються моноклональними антитілами до їх мембранних антигенів, кон'югованих флуорохромами. У разі одночасного вивчення кількох маркерних антигенів використовують мічення флуорохромами, контрастними за кольором. Клітини, оброблені міченими антитілами, перетинають промінь лазера і генерують різні сигнали (від прямого та бічного світлорозсіювання та від свічення різних флуорохромів), які реєструються та аналізуються приладом. Результати комп'ютерногоаналізу виражаються у вигляді одно- та двопараметричних гістограм, що відображають розподіл клітин за інтенсивністю світіння одного або двох флуорохромів. Результати виражають у відсотках мічених клітин та середньою інтенсивністю світіння. У разі використання двох флуорохромів враховують відсоток клітин, мічених кожним типом флуорохрому та обома барвниками одночасно.
Оцінка порушень природного імунітету
При лабораторній оцінці порушень природного імунітету зазвичай визначають фагоцитарну активність або генерацію метаболічно активних радикалів і оцінюють стан системи комплементу. Хоча визначення показників фагоцитозу (фагоцитарний індекс та фагоцитарне число) за допомогою мікроскопічного підрахунку фагоцитуючих клітин та фагоцитованих об'єктів є методично коректним, існують модифікації методу, що дозволяють стандартизувати та автоматизувати реєстрацію його результатів. Наприклад, фагоцитоз частинок латексу, мічених флуорохромом, що дозволяє реєструвати результати цитофлуориметрично.
Широко поширений метод оцінки активності фагоцитуючих клітин відновлення нітросиного тетразолію. Результати визначення дозволяють оцінити генерацію формазану за появою синього забарвлення. Аналогічний результат дають люмінесцентні методи реєстрації утворення метаболічно активних форм кисню та вільних радикалів методами реєстрації хемілюмінесценції, що посилюється люмінофорами (люмінолом та люцигеніном). Раніше стан системи комплементу оцінювали з використанням громіздкої гемолітичної системи. В даний час стало доступним визначення факторів комплементу методом ІФА
Оцінка гуморальної ланки
Визначення факторів гуморального імунітету включає підрахунокВ-лімфоцитів у периферичній крові, визначення концентрації імуноглобулінів основних класів, а в особливих випадках субкласів IgG. Адекватними тестами на B-лімфоцити є їх цитофлуориметричне визначення з використанням поліклональних антитіл до загальних детермінантів імуноглобулінів або моноклональних антитіл до одного з пан-В-клітинних маркерів, найчастіше CD19, 20 або 72. Методом подвійної імунофлуотел мічених різними флуорохромами, у спеціальних випадках визначається субпопуляція В1.
Концентрацію IgM, IgG, IgA, а також типи легких ланцюгів імуноглобулінів зазвичай визначають методом радіальної імунодифузії по Манчіні, з використанням поліклональних антитіл. Однак в особливих випадках для цього використовують імуноферментні (зазвичай імуносорбентні) тест-системи та моноклональні антитіла. Ізотипи IgG визначають виключно за допомогою імуноферментних тест-систем та моноклональних антитіл. Визначення IgE проводять радіоімунним та імуноферментним методами в рамках алергологічного обстеження.
Оцінка клітинної ланки
Маркери В-клітин: CD 19+, CD20+, CD 72+ Субпопуляція В1: СD19+CD5+ “Наївні” Т-клітини: CD45RA+ Т-клітини пам'яті: CD45RO+ Т-хелпери: CD3+CD4+ Індуктори хелперів: CD4+CD29+ Цитотоксичні (кілерно-супресорні) лімфоцити: CD3+CD8+ Індуктори супресорів: CD4+CD45RO+ Субпопуляція прекілерів: + CD11b + Попередники супресорів: CD8 + Leu7 Класичні NK-клітини: CD56 + CD57 + БГЛ (суфракція К-клітин): СD16 + CD3 - Ефекти антитілзалежної клітинної цитотоксичності (природні кілери, які мають активність К-кілерів): CD56 + CD16 + NKT-клітини (T-лімфоцити з активністю неспецифічних кілерів): CD3 + CD56 + /CD16 +
Мітогенна стимуляція
Як Т-клітинні мітогени застосовують фітогемагглютінін (ФГА), рідше конканавалін А (КонА). Як В-клітинний мітоген – бактеріальний ліпополісахарид. Для індукції тимузалежної гуморальної відповіді (здійснюють В-клітини за участю Т-хелперів) використовують мітоген лаконоса.
Визначення цитокінів у біологічних рідинах
Дедалі ширше поширюються методи визначення цитокінів у сироватці крові та інших біологічних рідинах (наприклад, ІЛ-1 та ІЛ-6, ФНПα у синовіальній рідині при ревматоїдному артриті), а також у супернатантах культур стимульованих клітин (моноцитів, макрофагів або лімфоцитів). Цей підхід дозволяє не лише оцінити рівень відповідних цитокінів, він дає можливість зіставити активність двох типів Т-хелперів – Th1 та Th2, що має значною мірою зумовлювати тактику імуномодулюючих впливів. Для визначення Th1- та Th2-лімфоцитів потрібні попереднє культивування в присутності ІЛ-2 (12-15 діб) та клонування проліферичних клітин. Передбачені клітини визначають цитофлуометрично за допомогою моноклональних антитіл до ключових цитокінів (ІФНγ та ІЛ-4), виявляючи ці цитокіни в цитоплазмі клітин.
Однак визначення цитокінів поки що дорого, і крім того є істотний недолік, властивий більшості функціональних тестів, - необхідність культивування клітин у стерильних умовах. Методи визначення цитокінів у біологічних тест-системах (костимуляція тимоцитів, підтримання зростання клітинних ліній, залежних від цитокінів) навряд чи мають перспективи практичного використання через громіздкість та неспецифічність.