Освітлювальна система світлового мікроскопа

“…Тому знати роль висвітлення у баченні мікроскопічних об'єктів є важливим. Тільки той має мікроскоп до кінця, хто знає також, як потрібно маніпулювати ірисовою діафрагмою під конденсором і чого можна і потрібно добиватися". академік Д.С. Різдвяний

Освітлювальні системи мікроскопів відіграють дуже важливу роль для формування зображення об'єкта, що досліджується, максимально достовірного оригіналу. При отриманні на мікроскопі зображення мікроскопічного об'єкта не слід втратити деталі. Мікрооб'єкт, будь-які крихітні його ділянки потрібно конгруентно зобразити в масштабі без спотворень форми і порушення кольоровості. Потрібне найуважніше ставлення до деталей. Звідси випливає суть теорії світлового мікроскопа, наукова основа теорії роздільної здатності та теорії виправлення аберацій у мікроскопі. Теоретично мікроскопа якості та функціональності освітлювальної системи відводиться дуже важливе місце. Теоретично роздільної здатності мікроскопа параметри освітлювальної системи прирівнюються до параметрів об'єктива. Теорія мікроскопа та мікроскопування доводять, що саме два ці вузли визначають “потужність” мікроскопа, його роздільну здатність.

Роздільна здатність мікроскопа безпосередньо залежить і від числової апертури об'єктива і не менше залежить від числової апертури освітлювального пристрою (у спрощеному розумінні – конденсора). Цей постулат легко перевірити, змінивши (збільшивши) в біологічному мікроскопі апертуру конденсора, нанісши на його фронтальну лінзу краплю іммерсійної рідини (збільшивши такий важливий параметр, як числова апертура конденсора), і порівнявши тонкість і точність малюнка зображення об'єкта з аналогічним зображенням без імерсії на конденсорі. Інша справа, що на практиці рідко завдаютьімерсійну рідину на конденсор, крапля розтікається, підсихає і тп, завдаючи певних незручностей. Але погодимося, що не використання імерсії в конденсорі не дозволяє реалізувати на мікроскопі максимальну роздільну здатність. Поряд з таким показником освітлювального пристрою мікроскопа, як числова апертура конденсора, важливу роль для отримання якісного зображення на мікроскопі грає абераційна корекція конденсора. Не тільки об'єктив, а й конденсор (освітлювальний пристрій мікроскопа) повинен мати якісну абераційну корекцію.

Мал. 1. Класичне уявлення мікроскопа

Відповідно до класичної теорії мікроскопа обов'язково в конденсорі (освітлювальному пристрої) мікроскопа виправляється т.зв. аберація неізопланатизму, оскільки зображення джерела світла має бути стигматично і забезпечувати високу рівномірність висвітлення об'єкта, що вивчається. Класичним прикладом є дволінзовий конденсор Аббе (з однією несферичною поверхнею у сучасних модифікаціях). Опис такого конденсора легко знайти в загальнодоступних джерелах. Такі конденсори комплектують переважну більшість навчальних, робочих та лабораторних мікроскопів. На малюнку відображено класичне уявлення про мікроскоп як оптичний прилад, що формує зображення дрібних об'єктів, не помітних при звичайному візуальному спостереженні. З малюнка видно, що для досягнення максимальної роздільної здатності на мікроскопі (тобто забезпечення "розгляду" мінімального розміру структури об'єкта) потрібно використання конденсора і об'єктиву, що мають однакову числову апертуру (в ідеальному випадку - використання двох однакових об'єктивів, одного з них якості конденсора).

Розглянемоваріанти рішень освітлювальних систем світлових мікроскопів Отже, якщо світло (або його частина), що йде з освітлювального пристрою, потрапляє безпосередньо в об'єктив, то фон виглядає світлим, тому таке освітлення називається освітленням за методом світлого поля. Якщо розмір джерела світла для освітлення об'єкта досить великий, то найпростішому разі його мають у своєму розпорядженні певному відстані “а” від площині предмета.

Якщо відстань "а" визначає положення площини, оптично пов'язаної з апертурною діафрагмою об'єктива, як показано на наступному малюнку, то мінімальний розмір джерела світла *, що заповнює світлом числову апертуру А об'єктива визначається співвідношенням:

Мал. 2. Висвітлення предмета безпосередньо джерелом світла

На малюнку представлений варіант висвітлення предмета безпосередньо джерелом світла. Очевидно, джерело світла можна розташувати ближче чи далі цієї площини за умови його зображення в апертурній діафрагмі об'єктива з допустимою величиною розфокусування, тобто в цьому випадку всі промені, що проходять через кожну точку площини предмета у зворотному напрямку, повинні потрапляти на поверхню джерела світла.

З конструктивних міркувань між площиною предмета і джерелом світла можна розташувати плоске дзеркало, як показано на малюнку. Якщо джерело світла досить малий, плоске дзеркало можна замінити увігнутим, яке формує збільшене зображення маленького джерела світла як показано на іншому малюнку.

На наступному малюнку представлений варіант освітлення плоским дзеркалом.

Мал. 3. Освітлення плоским дзеркалом

На наступному малюнку представлений варіант висвітлення з увігнутим дзеркалом.

Мал. 4. Освітлення з увігнутим дзеркалом

Однак, при середніх та великих числових апертурах мікрооб'єктива протяжності джерела світла або збільшення її за допомогою увігнутого дзеркала, як правило, недостатньо. Саме досягнення необхідних розмірів зображення джерела світла застосовують спеціальні оптичні системи, звані конденсорами.

Спосіб освітлення, коли джерело світла конденсором зображується у площині предмета, раніше застосовувався дуже широко. В Англії він був названий "критичним способом висвітлення".

Для того щоб площина предмета була освітлена рівномірно, джерело світла має випромінювати енергію по всій поверхні рівномірно. Насправді такі джерела світла зустрічаються рідко. Тому в даний час використовуються звичайні джерела світла у поєднанні зі спеціальною додатковою оптичною системою, названою колектором.

Природно, освітлювальна система світлового мікроскопа дещо ускладнюється, проте дозволяє забезпечити якісне рівномірне освітлення, що повною мірою забезпечує необхідну апертуру і здатність, що дозволяє.

Отже, вхідна зіниця конденсора оптично пов'язана з апертурною діафрагмою об'єктива; у площині вхідної зіниці конденсора розташовується ірисова діафрагма, яка виконує роль апертурної діафрагми оптичної системи мікроскопа. Якщо спостерігати отвір колектора з точок утвореного ним зображення джерела світла, воно виглядатиме однаково яскравим по всій поверхні. Конденсор, у свою чергу, зображує ірисову діафрагму, розташовану в безпосередній близькості до колектора, у площині предмета. Таким чином, ірисова діафрагма у вхідній зіниці конденсора служить для регулювання заповнення світломвихідної зіниці об'єктива, а ірисова діафрагма поблизу колектора – для регулювання величини поля, що освітлюється. Цей спосіб вперше був запропонований Келер і називається освітленням за методом Келера.

На представленому нижче малюнку (“однакових” малюнках) зображено важлива оптична система світлового мікроскопа з освітлювальним пристроєм, що формує освітлення методом Кёлера. Оптичні системи окремих вузлів схеми замінені умовними основними площинами. Колектор 2 зображує джерело світла 1 апертурну ірисову діафрагму 4 конденсора 5, який проектує польову діафрагму 3 колектора в площину предмета. Паралельні пучки променів, що виходять з конденсора, рівномірно висвітлюють прозорий предмет у межах зображення польової діафрагми колектора і далі падають на об'єктив 7 мікроскопа. Кут, що утворюється з оптичною віссю променем, що виходить з осьової точки предмета і прямує в край зіниці, є переднім апертурним кутом мікрооб'єктива.

Мікрооб'єктив 7 утворює дійсне, перевернуте і збільшене зображення предмета передньої фокальної площини окуляра 10 (тобто в площині польової діафрагми мікроскопа 9). У задній фокальній площині об'єктива, де утворюється зображення джерела світла, розташовується апертурна діафрагма мікроскопа 8. Вихідна зіниця 11 мікроскопа, де розташовується око спостерігача, є зображенням апертурної діафрагми 8.

Мал. 5. Оптична система світлового мікроскопа з освітлювальним пристроєм, що формує освітлення методом Кёлера

Мал. 6. Оптична система світлового мікроскопа з освітлювальним пристроєм, що формує освітлення за методом Келера (менш контрастне зображення)

Наявність уосвітлювальній системі ірисових апертурної діафрагми конденсора та польової діафрагми колектора дозволяє роздільно регулювати величину числової апертури та розмір освітлюваного поля. Насправді ця можливість дозволяє ефективно перерозподіляти світлові потоки в освітлювальній системі, отже, й у оптичному мікроскопі загалом. Ми не випадково представили два “однакові” малюнки. Якщо придивитися уважно, один із малюнків більш контрастний, загальне сприйняття його, можливо, зручніше і комфортніше. Але другий малюнок, який виглядає "блідішим", дозволяє краще розрізнити дрібні деталі.

Це добре видно на зображеннях бі-штрихів у цифр 1" та 3". Таким чином ми ілюструємо очевидне суперечність між вищим контрастом (комфортом спостереження) і максимальною роздільною здатністю для розрізнення мінімальних фрагментів структури досліджуваного об'єкта. Цей постулат досить складно ілюструвати на фотографіях реальних мікроскопічних об'єктів, тому що будь-яка проекційна система на плівку (або електронний приймач) неминуче знижує якість зображення в порівнянні з візуальним каналом світлового мікроскопа, не дозволяє відобразити такі нюанси. Тим часом саме такими нюансами відрізняється теорія та практика мікроскопування.

Які ж висновки можна зробити з наведених вище міркувань, яке практичне застосування може мати викладені тези?

Мікроскопи, що не мають конденсора (замість нього використовується поворотний диск з отворами різних діаметрів) придатні для "дитсадка", здатні забезпечити апертуру не більше 0.20, що відповідає об'єктиву збільшенням не більше 20х. Відсутня також польова діафрагма. За умовною класифікацією - "іграшка".
Мікроскопи, що використовують конденсор із маркуванням А=1.25. Виробники дещо лукавлять, оскільки числова апертура вказана для випадку використання олійної імерсії, яку "в реальному житті" практично ніхто не завдає.

За умовною класифікацією - "профпридатні". Зрозуміло, які мікроскопи мають реально працюючі ірисові польову діафрагму колектора і апертурну діафрагму конденсора. Як правило, для комплектації таких мікроскопів передбачена можливість застосування декількох видів конденсорів, що відрізняються числовими апертурами, можливістю використання різного роду імерсій, абераційною корекцією та ін. та апертурними діафрагмами. Це накладний освітлювач до Біол – МікМед-1” (шифр ОІ-21), легендарний мікроскоп “Бімам-МікМед-2”, мікроскоп дослідницький “Біолам-І”, що має ще й панкратичну (з плавною зміною збільшення) освітлювальну систему.

Слідкуйте за анонсами. Протягом цього року ми представимо кілька статей, присвячених освітлювальним системам світлових мікроскопів. Ось приблизні теми:

вплив аберацій в освітлювальних системах світлових мікроскопів.
про необхідність виправлення в конденсорах та освітлювальних пристроях дослідних та лабораторних мікроскопів хроматичних аберацій. Особливо це стосується хроматичних аберацій положення.
про необхідність виправлення в конденсорах та освітлювальних пристроях дослідницьких та лабораторних мікроскопів аберацій у зіницях. Особливо це стосується випадків реалізації таких методів контрастування, як фазовий контраст та ін.
переваги застосування телецентричного ходупроменів у освітлювальних системах сучасних світлових мікроскопів.