Персональний сайт - Метод розподільчої хроматографії на папері

Метод розподільчої хроматографії на папері

Метод розподільчої хроматографії на папері є точним та доступним методом для поділу суміші амінокислот. При цьому методі як адсорбент використовують спеціальний фільтрувальний папір. Хроматографію проводять у закритій камері, щоб уникнути випаровування розчинника.

Поділ суміші амінокислот методом розподільчої хроматографії на папері використовують для визначення амінокислотного складу білка, для якісного та кількісного визначення амінокислот у біологічних рідинах та тканинах. Цей метод дозволяє виділити окремі речовини із невеликої кількості складної суміші.

Радіальна хроматографія є одним з різновидів методу розподільчої хроматографії.

Принцип методу. Окремі амінокислоти мають різну розчинність у двох частково змішуються рідинах, однією з яких є вода, інший - водонасичений органічний розчинник, наприклад ізопропанол (фенол, бутанол та ін.) З двох частково змішуються рідин один розчинник повинен бути полярним (нерухома фаза), а інший неполярним – рухлива фаза. Більш гідрофобна амінокислота або інша речовина, що краще розчиняється в неполярному розчиннику, рухається з більшою швидкістю від лінії старту, ніж гідрофільна амінокислота. В результаті цього суміш амінокислот після закінчення хроматографічного поділу виявляється на різній відстані від лінії старту.

Радіальну хроматографію проводять на папері у чашці Петрі. Розчинник переміщається від центру до периферії та захоплює амінокислоти, які розподіляються концентричними колами та виявляються після висушування паперу та проведення нінгідринової реакції.

Реактиви, обладнання,досліджуваний матеріал

Ізопропіловий спирт, насичений водою (змішати ізопропанол з дистильованою водою у співвідношенні 7:3)
Нінгідрин, 0,2% розчин в ацетоні або етиловому спирті 96%.
Чашка Петрі (дві половинки одного діаметра 11см)
Хроматографічний папір (диск діаметром 12 см або квадрат зі стороною 12 см)
Ножиці
Сушильна шафа
Пінцет.
Лінійка.
Олівець простий.
Крапельна піпетка або пульверизатор
Автоматичний дозатор з об'ємом 5 мкл. чи капіляр.
Піпетка одноразова
Розчини амінокислот

Виріжте паперовий квадрат зі стороною 12 см. або диск діаметром 12 см. Це заготовка для хроматограми (сторони паперової заготовки повинні бути на 1см більше діаметра чашки Петрі).
Проведіть у заготівлі діагоналі простим олівцем. Заготівлю треба тримати за краї, щоб уникнути появи відбитків пальців на хроматограмі!
У точці перетину діагоналей зробіть отвір (≈ 0,5 см).
З хроматографічного паперу виріжте прямокутник розміром 2х3 см, згорніть його в трубочку по довжині прямокутника - це ніжка для заготівлі.
Одягніть ніжку в отвір заготовки.
Відступивши від центру на 1 см, у кожному секторі заготовки обводьте простим олівцем кружки діаметром 0,5 см і позначте їх цифрами 1,2,3,4.
У кружки 1,2,3 нанесіть відповідні амінокислоти аланін (1), глутамінова (2), лейцин (3), а в кружок 4 нанесіть суміш цих амінокислот. Для кожної амінокислоти потрібно брати чистий наконечник! Розмір плями амінокислоти, що наноситься, не повинен виходити за краї кружка.
Після нанесення амінокислот заготовку необхідно просушити 10 хвилин на повітрі, щоб не було вологої плями.
На дно чашки Петрі налийте 10-12 мл водонасиченого розчину ізопропілового спирту. Заготовку покладіть на чашку Петрі так, щоб ніжка заготовки була занурена в розчин, а паперова заготовка лежала на краях нижньої половинки чашки. Чашку Петрі накрийте кришкою (якщо ніжка висока, підріжте її ножицями до потрібної висоти) і проведіть хроматографічне поділ протягом години при кімнатній температурі. По ніжці розчинник піднімається нагору і розподіляється по колу паперу, захоплюючи у себе нанесені амінокислоти. При цьому відбувається поділ досліджуваної суміші на окремі амінокислоти, що рухаються з різною швидкістю, відповідно до коефіцієнтів їх розподілу меду водою та ізопропанолом.
Коли фронт розчинника дійде майже до краю заготовки, кришку чашки Петрі зніміть, на неї покладіть заготовку зверху, утримуючи пінцетом її краю, обведіть простим олівцем фронт розчинника.
Помістіть хроматограму в термостат при температурі 90 - 100 о С на 10 хвилин з метою усунення розчинника та фіксації амінокислот.
Залишки розчинника піпеткою злийте назад у ємність.
Для виявлення плям амінокислот хроматограму обприсніть 0,2% розчином нінгідрину з пульверизатора (або залийте з піпетки) і знову висушіть у сушильній шафі при температурі 90 - 100 про 5 хвилин. При цьому проявляються амінокислоти у вигляді окремих смуг, забарвлених у рожево-фіолетовий колір, де кожна пляма відповідає певній амінокислоті.
Порівнюючи розташування плям досліджуваної суміші в секторі 4 (досвід) з положенням плям окремих амінокислот в секторах 1,2,3 (контролях), встановіть присутність у суміші певних амінокислот. Для чого розрахуйте для кожної амінокислоти коефіцієнт розподілу - Rf або швидкість переміщення поформулі: Rf = a/ b , де a – відстань у міліметрах, пройдена амінокислотою від місця нанесення амінокислоти до середини її плями; b – відстань у міліметрах від місця нанесення амінокислоти до фронту розчинника. Чим менша розчинність амінокислоти у воді і чим більша її розчинність в органічному розчиннику, тим швидше вона рухається слідом за фронтом розчинника, тим більша величина Rf і, навпаки, чим більша її розчинність у воді і менше в органічному розчиннику, тим повільніше амінокислота буде пересуватися і тим менше величина Rf. Коефіцієнт розподілу Rf – величина постійна кожної амінокислоти за постійних умов досвіду (температура, сорт паперу, розчинник).
Порівняйте коефіцієнти розподілу відомих стандартних амінокислот (в контрольних секторах 1,2.3) з коефіцієнтом розподілу амінокислот, виділених з досліджуваної суміші (в дослідному секторі 4) і зробіть висновок наявність окремих амінокислот в досліджуваному матеріалі.
Запишіть висновок, приклейте хроматограму або прикріпіть степлером у зошит.