Підготовка матеріалу для роботи з мікроскопом
Біологічні об'єкти можна досліджувати як живими, і фіксованими. В останньому випадку для більш ретельного вивчення матеріал можна розділити на частини та обробити різними барвниками, щоб виявити та ідентифікувати ті чи інші структури. З об'єкта, що досліджується, можна приготувати тимчасові або постійні препарати. Фіксація препаратів Фіксація - це збереження матеріалу в стані, близькому до природного. Для цього необхідно швидко умертвити тканини, що найкраще досягається з невеликими шматочками живого матеріалу. Речовина, що використовується для цього, називається фіксатором. Швидкою фіксацією досягається збереження початкової структури об'єкта, причому тканини ущільнюються настільки, що можна готувати тонкі зрізи. Зневоднення препаратів Зневоднення проводиться при підготовці матеріалу до заливання або для укладання його у відповідне середовище, яке не змішується з водою. Воду необхідно видалити також тому, що інакше препарат згодом буде зруйнований бактеріями. Для того щоб зберегти ультраструктуру, зневоднення треба проводити поступово, обробляючи матеріал поряд водних розчинів етанолу або пропанону (ацетону) з дедалі більшою концентрацією, і закінчити обробку «абсолютним» (безводним) етанолом або пропаноном. Просвітлення препаратів Деякі із загальновживаних середовищ для заливання та укладання не змішуються зі спиртом. Тому його треба поступово заміщати середовищем (просвітлюючою речовиною), з якою заливальне середовище змішується, наприклад, ксилолом. Це також призводить до того, що матеріал стає прозорим. Заливка препаратів Для того, щоб за допомогою мікротома отримати дуже тонкий зріз, необхідно, щоб матеріал був залитий у відповідне опорне середовище. Приприготуванні препаратів для світлової мікроскопії об'єкти заливають у парафін, якому потім дають охолонути. Для електронної мікроскопії доводиться використовувати твердіші речовини (пластмаси чи смоли), оскільки тут необхідні особливо тонкі зрізи, отже, і опора має бути щільнішою.
Виготовлення зрізів препаратів Як правило, товщина шматочків матеріалу дуже велика, щоб крізь них могло пройти достатню для дослідження під мікроскопом кількість світла. Зазвичай доводиться зрізати дуже тонкий шар матеріалу, що досліджується, тобто готувати зрізи. Зрізи можна робити бритвою або на мікротомі. Вручну зрізи готуються за допомогою гостро відточеної бритви. Для роботи на звичайному мікроскопі зрізи мають бути товщиною 8-12 мкм. Тканину закріплюють між двома шматочками серцевини бузини. Бритву змочують рідиною, у якій зберігалася тканина; зріз роблять через бузину і тканину, причому бритву тримають горизонтально і рухають її до себе повільним ковзним рухом, спрямованим трохи навскіс. Швидко зробивши кілька зрізів, слід вибрати з них найтонший, що містить характерні ділянки тканини. Зріз із тканини, залитої в те чи інше середовище, можна зробити на мікротомі. Для світлового мікроскопа зрізи завтовшки кілька мікрометрів можна зробити із залитої в парафін тканини за допомогою спеціального сталевого ножа. На ультратомі виготовляють надзвичайно тонкі зрізи (20-100 нм) для електронного мікроскопа. В цьому випадку необхідний алмазний чи скляний ніж. Зрізи для світлового мікроскопа можна приготувати, не заливаючи матеріал у середу; для цього використовують заморожуючий мікротом. У процесі приготування замороженого зрізу зразок зберігається у замороженому і, отже, у твердому стані. Забарвлення препаратів Як правило, біологічні структури напрепарати прозорі, тому для отримання контрасту між ними доводиться вдаватися до різних засобів. Найпоширенішим є фарбування. Деякі барвники, що використовуються у світловій мікроскопії, перелічені у таблиці. Певні барвники в низьких концентраціях не токсичні для живих тканин, тому можуть застосовуватися для фарбування живого матеріалу. Їх називають прижиттєвими (вітальними) барвниками. До них відносяться, наприклад, метиленовий синій та нейтральний червоний. При фарбуванні парафінових зрізів парафін видаляють за допомогою розчинника, а зріз перед фарбуванням частково обводняють. Повністю забарвлені зрізи укладають на предметному склі в спеціальне середовище, наприклад канадський бальзам або еупарол; вона пропускає повітря, отже зріз може зберігатися у ній необмежено довго. В'язень у середу зріз накривають покривним склом. Послідовність описаних вище дій є типовою, коли йдеться про приготування тонких зрізів для постійних препаратів. Однак часто в порядок дій вносять дві наступні зміни: а) якщо зріз сирого матеріалу готують вручну, спочатку роблять зріз, а потім його фіксують; б) фарбувати можна після фіксації або в процесі зневоднення на будь-якій його стадії. Наприклад, барвником, розчиненим у 50%-му етанолі, можна пофарбувати зріз після його зневоднення в 50%-му етанолі. Описана процедура приготування препаратів в основному подібна як для світлового, так і для електронного мікроскопів, хоча є деякі відмінності в деталях.