Штам бактерій bacillus subtilis, що використовується для отримання пробіотичного препарату,
Винахід відноситься до біотехнології, ветеринарії та може бути використане для отримання препарату з групи пробіотиків. Штам бактерій Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д виділений із ґрунту. Клітини грампозитивні, капсули не утворюють, утворюють круглі суперечки, тип аеробний дихання. Гідролізує глюкозу, маніт. Не зброджує сахарозу, інозит, сорбіт, мальтозу, лактозу. Не утворює газу при зброджуванні. Пригнічує зростання стафілококів, кишкової палички, ентеробактерій, цитробактерій, аеромонас. Штам використовують як виробничий для отримання пробіотичного препарату "Субтіліс". Препарат нормалізує діяльність шлунково-кишкового тракту тварин, птахів, риб; перспективний у лікуванні та профілактиці бактеріальних інфекцій. 1 табл.
Малюнки до патенту Україна 2184774
Винахід відноситься до біотехнології і може бути використане в мікробіологічній промисловості для отримання пробіотичного препарату, що застосовується у ветеринарії при лікуванні та профілактиці шлунково-кишкових захворювань тварин, птиці та риб.
Відомий штам Bacillus subtilis 534 – продуцент пробіотика "Споро-бактерин", який призначений для профілактики та лікування шлунково-кишкового тракту, дисбактеріозів. SU 1708350, кл. А 61 До 35/66.
Недоліками є невеликі терміни зберігання, т.к. містить живі бактерії, які можуть тривалий час зберігати свої властивості, низька чистота препарату, що має вузьку область застосування - як кормова добавка для тварин. Штам також чутливий до антибіотиків за винятком поліміксину, що обмежує сферу застосування препарату.
Відомий штам Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, що виявляє інгібуючу активність по відношенню до патогенних видів мікроорганізмів і має множинну лікарську стійкість. Штам резистентний до тетратцикліну, рифампіцину, аленіциліну, хлорамфеніколу, апректоміцину. На його основі готують антибіотикорезистентний пробіотик для лікування та профілактики інфекційних захворювань при однойменній антибіотикотерапії (UA 2118364 С1, кл. 12 N 1/20, 27.08.1988).
Завданням, на вирішення якого спрямовано винахід, є виявлення нового ефективного штаму-продуцента пробіотичного препарату "Субтіліс" для ветеринарних цілей та рибного господарства.
Технічний результат, що досягається при здійсненні винаходу, полягає у підвищенні ефективності лікування, збільшення засвоюваності кормів, продуктивності та приросту ваг тварин, птиці, риб за рахунок використання "Субтиліс", стабільності препарату при зберіганні в широкому діапазоні температур зовнішнього середовища.
Штам Bacillus subtilis В-1601Д депонований у Всеукраїнській колекції мікроорганізмів (ІБФМ ім. К.Г.Скрябіна) під ВКМ В-2250Д.
Штам Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д виділений із ґрунту.
Умови зберігання: штам може зберігатися в ліофілізованому стані протягом декількох років або на одвірках з агаризованим середовищем на основі м'ясопептонного бульйону з обов'язковим пересіванням не рідше 1 разу на 2 місяці на це ж середовище.
Культурально-морфологічні ознаки. Палички. Розмір клітин однодобової агарової культури 3-5 мкм. Клітини забарвлюються позитивно за Грамом, утворюють круглі суперечки, одиночні, центральні діаметри менше діаметра клітини. Колонії на МПА білі, пігмент у середу не виділяють.
фізіологічні ознаки. Аероб, оптимальна температура зростання 37 o С та рН4,0-8,0. Можливе зростання діапазоні температур 4-60 o З. Ставлення до NaCl - зростання при 2-5%.
Біохімічні ознаки Розщеплює глюкозу, маніт. Незброджуються сполуки вуглецю: сахароза, інозит, сорбіт, мальтоза, лактоза. Утилізує цитрат та ацетат. При зброджуванні не утворює газу. Продукує оксидазу, каталазу.
Антагоністичні ознаки. Пригнічує зростання стафілококів, протею, клебсієлл, кишкової палички, ентеробактерій, нітробактерій, аеромонас, дріжджових грибів.
Штам не є патогенним для рослин, тварин, риб та людини.
Дані таблиці показують антагоністичну активність тестових штамів мікроорганізмів (метод відстроченого антагонізму).
Для культивування штаму Bacillus subtilis BKM В-2250Д використовують рідке живильне середовище на основі 3% ФГМС, рН 6,8-7,0, що містить 0,2% глюкозу (по сухій речовині), 0,005% амінопептидазу або 0,0 .
Попередньо суху біомасу мікроорганізмів висівають у пробірку з бульйоном. З появою видимого зростання колонії пересівають на м'ясопептонний агар у пробірки.
Відбирають типові колонії, які пересівають рідке середовище у флаконах. Через 24 год всю вирослу масу переносять в 15-літрову сулію з 9 л живильного середовища і культивують 22 год при 37-40 o З отримуючи посівний матеріал.
Поживне середовище на основі ФГМС поміщають у реактор, стерилізують при 1 атм 60 хв, охолоджують до 39 o З і засівають посівним матеріалом з бутлі у співвідношенні 1:9.
У процесі аеробного культивування рН середовища підтримують у межах 6,8-7,2, підживлюючи середовище 40% глюкозою до кінцевої концентрації 0,1-0,2%. При досягненні концентрації 20 млрд бактеріальних клітин припиняють додавання глюкози до зниження рН 4,5 і відключають подачу повітря. Потім відключаютьобігрів реактора, середу охолоджують до 20 o С. Отриману культуру охолоджену перекачують в ємності або розфасовують у флакони.
Препарат "Субтіліс" нешкідливий, не містить сторонньої мікрофлори. Нешкідливість перевірена на білих мишах масою тіла 18-20 г, яким перорально вводили препарат обсягом 1,0 мл.
"Субтиліс" має специфічну активність: кількість клітин в одній дозі препарату (15-20) млрд. кл/мл, антагоністична активність - зона затримки зростання тестових мікроорганізмів становить від 6 до 34 мм.
Винахід пояснюється прикладами.
Приклад 1. Бактеріальна геморагічна септицемія коропа.
У ставковому господарстві захворіли дворічки коропа з клінічними ознаками бактеріальної геморагічної септицемії. Кількість хворих риб сягала 43%. Лабораторний аналіз патматеріалу підтвердив наявність патогенної полівидової мікрофлори у внутрішніх органах риб. Призначено лікування з додаванням до корму шляхом його змочування 2,5 млн. мікробних клітин (спор) "Субтиліс" на 1 кг живої маси тіла риби. Корм із "Субтіліс" давали рибі 1 раз на день протягом 5 днів. Через 10 днів після закінчення курсу лікування встановлено, що кількість хворих на риб зменшилася до 4%, а ознаки гострого запалення залишилися лише в окремих екземплярів. Поверхня тіла риб стала поступово ослизнена.
Приклад 2. Аеромоноз (краснуха) коропа.
У ставковому господарстві при різкій зміні умов зовнішнього середовища трирічки коропа захворіли на аеромоноз (краснуху) з наявністю яскравих ознак гострої стадії хвороби та загибеллю риби. Щоденна загибель риб становила 5% від загальної кількості. Бактеріологічно встановлено переважання аеромонад, що склали понад 80% від загальної кількості виділених із риби патогенів. Призначено курс лікування кормом, змоченим"Субтіліс", у дозуванні 2,5 млн. суперечка на 1 кг живої маси тіла риби. У зв'язку зі зниженою поедаемостью курс дачі корму було визначено 1 щодня протягом 7 діб. Вже на 5-ту добу годування загибель риби зменшилася до 0,3-06% від загальної кількості, на 20-ту добу після закінчення курсу настало загальне оздоровлення стада.
Приклад 3 Некроз плавників форелі.
У форелевом господарстві спостерігалося ураження форелей гострою формою некрозу плавників. Мікробіологічне дослідження патматеріалу виявило наявність у ньому патогенів кишкової палички, ентеробактеру, цитробактера та аеромонас (Aeromonas verenii, Aeromonas caviae). Спільне культивування "Субтиліс" з цією асоціацією мікроорганізмів показало його антагоністичну активність і викликало повну загибель патогенів на 4 добу. Дозування "Субтіліс" становило 1-2 млрд. спір.
Приклад 4. Збереження курчат у перші тижні.
На великій птахофабриці проведено виробничі випробування ефективності "Субтіліс" на збереження курчат у перші два тижні після їх посадки. Програма випробувань передбачала уточнення оптимальних дозувань "Субтиліс", а також його застосування в рідкому та ліофільно висушеному видах. Відхід курчат контрольної групи становив 2,38%. Усереднений відхід у дослідних групах становив: при дачі ліофільно висушеного "Субтіліс" з кормом - 1,33%, при випоюванні рідкого "Субтіліс" - 0,33%. У досвідчених групах курчата інтенсивніше набирали вагу. Результати зважування після перших трьох днів дали для контрольної групи 61 г, для дослідної – 70 г.
Приклад 5. Захворювання новонароджених поросят.
На великому комплексі вирощування свиней протягом тривалого часу спостерігався значний (до 70-80%) відхід поросят у зв'язку із захворюваннями шлунково-кишкового тракту. Проведенімікробіологічні та патологоанатомічні дослідження виявили у поросят кілька видів захворювань ШКТ бактеріальної етіології, серед яких найбільш суттєвими були ознаки гастроентерополіту. Призначений курс лікування: застосування "Субтіліс" внутрішньо відразу після народження з розрахунку 1 доза на 5 поросят на 10% глюкозі протягом 4-5 днів. Курс профілактики: застосування "Субтіліс" внутрішньо з розрахунку 1 доза на 10 новонароджених поросят на 10% глюкозі протягом 3 днів. Безпека поросят піднялася до 92,5% і стабільно підтримується профілактикою на цьому рівні.
Проведені дослідження показали ефективність наведених кількостей пробіотичного препарату, що додається до корму.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Штам бактерій Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д, що використовується для отримання пробіотичного препарату "Субтіліс", призначеного для профілактики та лікування шлунково-кишкових захворювань тварин, птиці та риби.