Спосіб гістологічної оцінки ступеня дозрівання м’яса
Власники патенту UA 2604138:
Винахід відноситься до галузі прикладної біотехнології. Спосіб гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса полягає у фіксації проб у формаліні, одержанні мікроскопічних препаратів та їх оцінки за структурою міофібрил. Пробу готують шляхом лужної дисоціації шматочків м'язів розміром 0,3*0,3*0,3 см у 40-50%-ному розчині KОН протягом 18-24 годин після їх фіксації в 10%-ному водному розчині формаліну протягом 12- 24 години, переносять у дистильовану воду і витримують у холодильнику 40-50 годин. М'язові волокна розділяють струшуванням, готують мазки і забарвлюють з оцінкою структури миофибрилл. На першому етапі дозрівання м'яса в мазках виявляються порушення цілісності окремих м'язових волокон за збереження ядер і смугастість. На другому етапі - у мазках виявляються порушення цілісності багатьох м'язових волокон за збереження ядер і смугастість. Для третього етапу характерний розпад окремих фрагментів на міофібрили, ядра та смугастість не виявляються. Винахід забезпечує підвищення точності оцінки та простоту підготовки проб.
Винахід відноситься до галузі прикладної біотехнології, зокрема способу гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса всіх видів забійних тварин і птиці, і може бути використане при визначенні автолітичних змін в м'ясі.
Недоліками цих методів є те, що визначення одного показника не дає повної картини автолізу і не може бути достатнім критерієм дозрівання м'яса. Для виконання достатнього для об'єктивної оцінки комплексу методів потрібні дорогі реактиви, необхідна трудомістка підготовка проб, пов'язана з подрібненням та екстрагуванням. В результаті змішування ми отримуємо усереднене уявлення прозмінах у м'язах.
Порівняно з цими методами вищою достовірністю та наочністю відрізняється гістологічне дослідження м'яса. Крім того, оцінка мікроструктурних показників м'яса дозволяє також визначити придатність його до зберігання та транспортування, обґрунтовано вирішувати питання про терміни його реалізації та раціональне використання, визначити фальсифікацію та ступінь доброякісності при розбіжностях у санітарній оцінці, не допускати втрат цінного білкового продукту (Морфологічні дослідження лабораторіях: Методичний посібник.Москва: МСГ РФ, Департамент ветеринарії, 2003. С. 69-70).
Недоліком даного способу є необхідність отримання гістологічних зрізів за допомогою дорогого приладу - мікротома, що заморожує, низька якість отриманих зрізів (товщина більше 15 мкм, погане збереження структури м'язів), складність гістологічної оцінки структури м'язових волокон в отриманих зрізах і недостатня точність отриманих зрізів. при різанні їх на мікротомі.
Завданням пропонованого винаходу є розробка способу гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса, що володіє високою точністю результатів і простотою обробки проб без використання мікротома, що заморожує. При цьому товщина мазків дорівнюватиме товщині м'язових волокон. Останні зберігатимуться на всьому їхньому протязі, що є ідеальним для оцінки мікроструктури.
Технічний результат, який може бути отриманий за допомогою запропонованого винаходу, зводиться до підвищення точності оцінки та простоти обробки проб.
Технічний результат досягається за допомогою способу гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса, що включає приготування проби та дослідження.Причому пробу готують шляхом лужної дисоціації фіксованих у формаліні шматочків м'язів, поділу м'язових волокон шляхом струшування, виготовлення мазків та забарвлення їх гістологічними барвниками з подальшою оцінкою ступеня дозрівання м'яса мікроструктурою міофібрил. При цьому фіксацію шматочків м'язів розміром 0,3*0,3*0,3 см проводять у 10%-ному водному розчині формаліну протягом 12-24 годин. Потім шматочки інкубують в 40-50% розчині лугу КОН протягом 18-24 годин, переносять у великий обсяг дистильованої води і витримують в холодильнику 40-50 годин. Отриману в результаті лужної дисоціації завись м'язових волокон зливають у чашку Петрі і інтенсивно струшують для остаточного поділу м'язів на окремі волокна, з яких готують мазки, висушують їх на повітрі, і після фарбування гістологічними барвниками оцінюють цілісність м'язових волокон, їх фрагмент наявність поперечної та поздовжньої смугастість.
Перший етап дозрівання м'яса характеризується тим, що в мазках виявляються поперечно-щілинні порушення цілісності або фрагментація окремих м'язових волокон при збереженні у фрагментах структури ядер, поперечної та поздовжньої смугастість. Другий етап дозрівання м'яса відрізняється тим, що в мазках виявляються множинні поперечно-щілинні порушення цілісності або фрагментація багатьох м'язових волокон при збереженні у фрагментах структури ядер, поперечної та поздовжньої смугастість. Для третього етапу дозрівання м'яса характерний розпад окремих фрагментів на міофібрили, а міофібрил - на саркомери у вигляді зернистої маси, укладеної в ендомізії. Ядра, поперечна і поздовжня смугастість практично не виявляються.
Приклад конкретного здійснення способу гістологічної оцінкиступеня дозрівання м'яса.
Досліджували автолітичні зміни в м'язах індичок, курей-несучок, коней та великої рогатої худоби. Вивчали зміни гістоструктури при охолодженні та зберіганні м'яса. Для гістологічного дослідження відбирали проби через певні часові відтинки. Проби розміром 0,3*0,3*0,3 см фіксували в 10% водному розчині формаліну протягом 12-24 годин. Потім шматочки інкубували в 40-50% розчині лугу КОН протягом 18-24 годин, переносили у великий обсяг дистильованої води і витримували в холодильнику 40-50 годин. Отриману в результаті лужної дисоціації завись м'язових волокон зливали в чашку Петрі і інтенсивно струшували для остаточного поділу м'язів на окремі волокна, з яких готували мазки, висушували на повітрі. Після фарбування мазків гематоксиліном та еозином оцінювали цілісність м'язових волокон, їх фрагментацію, збереження клітинних ядер, наявність поперечної та поздовжньої смугастість.
В індичок через 15 хв після забою м'язові волокна перебувають у розслабленому стані. Вони прямі, рівні з чітко вираженою поперечною смугастістю. М'язові волокна грудного м'яза відрізняються великим діаметром проти м'язом стегна. Через 2 години м'язові волокна набухають, що підтверджується збільшенням їх діаметра. Поперечна смугастість на окремих ділянках зберігається і найбільш виражена в стегновому м'язі. Зникнення поперечної смугастість м'язових волокон - характерна риса автолізу, що розвивається. Після 4 год зберігання м'язові волокна потовщуються, їх межі набувають менш виразних форм. Більшість м'язових волокон грудного м'яза приймають слабопомітну хвилеподібну конфігурацію. Ядра мають нечітку форму. Це означає, що в грудному м'язі протікає інтенсивніший гліколіз. Приподальшому зберіганні (6 год) форма м'язових волокон грудного м'яза набуває вигляду вигнутої хвилястої лінії. М'язові волокна у зразку стегнового м'яза мають ділянки з гомогенізацією. При дозріванні м'яса (8 год) у грудному м'язі відзначаються гомогенізовані ділянки, у стегновому м'язі – потовщення та стискування м'язових волокон, з якими зливається ендомізій. Це свідчить про закручування м'язів. Зберігання м'яса протягом 10 год призводить до набухання м'язових волокон, межі з-поміж них неясні. Через 12 год товщина м'язових волокон зменшується, що пов'язано з розпадом актиноміозинового комплексу та роздільною здатністю посмертного задублення. Через 24 години після забою у зразках відзначається деструкція міофібрил на окремі саркомери у вигляді зернистої маси, відзначаються розриви та тріщини. Такі зміни структури відбуваються зазвичай на стадії дозрівання м'яса, коли збільшується ніжність, покращується смак та аромат м'яса.
В результаті досліджень діаметра м'язових волокон у м'ясі індички встановлено, що їх найбільші значення були в період максимального задублення м'язів: через 6 год – для грудного м'яза та 8 год – для стегнового м'яза. Таким чином, у результаті експериментальних досліджень встановлено, що м'ясо індичок відрізняється від інших видів м'яса птиці швидкістю протікання автолітичних процесів. При ідентичному характері автолітичних змін у грудних м'язах, у порівнянні з стегновими, відзначається більш ранній та глибокий гліколіз, що відбивається на якості м'яса. Виявлені особливості автолізу вказують на необхідність диференційованого підходу до можливих термінів використання окремих ділянок тушки індички під час виробництва м'ясних продуктів.
У курей-несучок через 30 хвилин після забою в грудних м'язах спостерігається перехід від посмертного розслаблення до посмертного задубрання. Через 1 годвідбувається зменшення довжини сарокмерів, тобто. до перехід до більш вираженого та поширеного скорочення актиноміозинового комплексу. Через 2 години після забою в грудних м'язах курей відбувається комплекс структурних змін характерних для посмертного задубрання. У стегнових м'язах у цей час відзначається наростання проявів посмертного задухи зі скороченням та укороченням саркомірів. Через 4 години після забою волокна грудних м'язів курей мають переважно випрямлену форму. Таким чином, використання м'яса курей-несучок можливе через 4-6 год після забою, т.к. до цього часу завершується посмертне задублення, а надалі відбуватиметься дозрівання м'яса.
У парній коніні м'язові волокна перебувають у розслабленому стані: вони набухають з чітко вираженою поперечною смугастістю, поздовжня ж смугастість згладжена. Ядра мають витягнуту паличкоподібну та зернисто-глибчасту структуру хроматину. Через 8 год після забою більшість м'язових волокон стають прямими або знаходять слабко помітну хвилеподібну конфігурацію. Після 24 год зберігання конфігурація м'язових волокон набуває звивистих обрисів, поперечна смугастість зберігається тільки в чотириголовому стегновому м'язі. Це означає, що у найдовшому м'язі спини протікає інтенсивніший гліколіз. На 2-у добу зберігання хвилеподібну конфігурацію набувають м'язові волокна чотириголового стегнового м'яза. На 4-ту добу після забою м'язові волокна набухають, поперечна смугастість згладжується, проявляється поздовжня фібрилярність. Ядра стають овальними, помітно визначається структура хроматину. На 7-му добу зберігання поперечна і поздовжня смугастість стає непомітною, ядра нечіткі, хроматинова структура в них не проглядається. На деяких волокнах спостерігається розпад саркомірів дозернистої маси. На 10-ту добу зберігання м'язові волокна стають набряклими, порушується цілісність або з'являється фрагментація їх із збереженням структури ядер. Такі глибокі зміни структури відзначаються на стадії дозрівання м'яса, коли збільшується ніжність, покращується аромат та смак м'яса.
Встановили, що гістологічні зміни, що протікають у м'язовій тканині коней, аналогічні змінам, що протікають у яловичині, проте за часом досягнення певної стадії автолізу різних м'язів є відмінності. У м'язовій тканині яловичини стадія посмертного задухи починається через 18-24 год і протікає до 2-3 діб, а власне дозрівання м'яса починається вже на 6 добу. Такі відмінності пов'язані із різною руховою активністю тварин.
Спосіб гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса дозволяє досить точно, швидко, без трудомісткої обробки проб визначити зміни м'язових волокон, у тому числі за допомогою кількісних морфометричних методів і на цій підставі констатувати стадії дозрівання м'яса. Пропонований винахід у порівнянні з прототипом та іншими технічними рішеннями має наступні переваги: високу точність оцінки ступеня дозрівання м'яса, простоту виконання без необхідності отримання гістологічних зрізів за допомогою дорогого приладу - мікротома, що заморожує.
Спосіб гістологічної оцінки ступеня дозрівання м'яса полягає у відборі проб, фіксації їх у формаліні, отриманні мікроскопічних препаратів та їх оцінки за структурою міофібрил, який відрізняється тим, що фіксацію шматочків м'язів розміром 0,3*0,3*0,3 см проводять у 10% -ном водному розчині формаліну протягом 12-24 годин, потім шматочки інкубують у 40-50%-ному розчині лугу КОН протягом 18-24 годин, переносять у великий обсяг дистильованої води івитримують у холодильнику 40-50 годин, отриману завись м'язових волокон зливають у чашку Петрі і інтенсивно струшують для остаточного поділу волокон, з яких готують мазки, висушують їх на повітрі, фарбують гістологічними барвниками та оцінюють цілісність м'язових волокон та їх фрагмент; на першому етапі дозрівання м'яса в мазках виявляються поперечно-щілинні порушення цілісності або фрагментація окремих м'язових волокон при збереженні у фрагментах структури ядер, поперечної та поздовжньої смугастість; на другому етапі дозрівання м'яса в мазках виявляються множинні поперечно-щілинні порушення цілісності або фрагментація багатьох м'язових волокон при збереженні у фрагментах структури ядер, поперечної та поздовжньої смугастість; для третього етапу дозрівання м'яса характерний розпад окремих фрагментів на міофібрили, а міофібрил - на саркомери у вигляді зернистої маси, укладеної в ендомізії, при цьому ядра, поперечна і поздовжня смугастість практично не виявляються.