Спосіб отримання колагенових імплантатів - патент Україна 2360690 - Лекішвілі Михайло Васильович,
Винахід відноситься до медицини, а саме до відновної хірургії, та призначене для отримання біологічного пластичного матеріалу. Сутність способу: як вихідний матеріал використовують сухожилля, зв'язки, фасції, тверду мозкову оболонку, перикард, хрящі людини і тварин, після механічного очищення тканину нарізають на фрагменти необхідного розміру, обробляють сумішшю розчинів 1% Triton x-100 і 3% дезоксихолату натрію ультразвуковій ванні при температурі 30°С протягом 3-6 годин з дворазовою зміною розчину, промивають проточною водою, обробляють 0,1 М розчином гідроксиду натрію протягом 10 годин, обробляють розчином, що містить 1 М соляної кислоти і 1 М хлориду натрію протягом 10 годин обробляють розчином, що містить 1 М хлориду натрію і 0,1 М фосфатного буфера протягом 10 годин, промивають 0,1 М розчином фосфатного буфера, триразово промивають дистильованою водою, ліофілізують, упаковують і стерилізують радіаційним способом. Використання способу дозволяє отримати колагенові імплантати з високим ступенем біосумісності, які можна використовувати для оперативного лікування сухожильно-зв'язувального апарату та пошкоджень інших м'яких тканин, як бар'єрних мембран, як носій клітин, лікарських засобів та біологічно активних речовин.
Винахід відноситься до медицини, а саме до відновлювальної хірургії, і призначене для отримання біологічного пластичного матеріалу, що використовується при оперативному лікуванні пошкоджень зв'язок, сухожиль та інших м'яких тканин, для закриття ранових поверхонь, бар'єрних мембран, а також як носія біологічно активних речовин , клітин, лікарських засобів.
Відомий спосіб отриманняколагену із кісткової тканини. За цим способом кісткову тканину механічно очищають, розпилюють на пластини товщиною від 0,1 до 2,0 см, промивають 0,1 М розчином фосфатного буфера з рН 5,8-6,0, перетравлюють у активному розчині 0,125-0,325% папаїну при 60°С протягом 24 годин, промивають 5 об'ємами води при 60°С, обробляють при кімнатній температурі протягом 10-14 годин 0,4 Н розчином лугу, відмивають проточною водою, обробляють 3% розчином перекису водню протягом 4 годин , потім знежирюють у суміші етанол/хлороформ у співвідношенні 1:2, проводять декальцинацію в 0,5-1,0 Н соляній кислоті, відмивають очищеною водою, етанолом і висушують при кімнатній температурі, фасують і стерилізують радіаційним способом (Патент Україна № 227349 2 травня 2006 року), який обраний за прототип, оскільки найбільш близький за своїм технічним рішенням пропонованого винаходу.
Недоліками зазначеного способу є те, що він застосовується тільки для отримання колагену з кісткової тканини, а використання при обробці папаїну призводить до зміни нативної структури колагену, що веде до зниження механічної міцності колагену і робить його більш доступним для клітинних ферментів, що призводить до прискорення резорбції імплантату в організмі реципієнта
Завданням винаходу є отримання колагенових імплантатів, придатних для операцій на м'яких тканинах.
Технічним результатом пропонованого способу є отримання колагенових імплантатів з високим ступенем біосумісності, які можуть бути використані при оперативному лікуванні для відновлення цілісності зв'язок, сухожиль, для закриття ранових поверхонь, бар'єрних мембран між тканинами різного виду, в якості носія біологічно активних речовин, клітин, лікарськихкоштів.
Технічний результат досягається тим, що в якості сировини використовують м'якоткані утворення сполучної тканини, після механічного очищення фрагменти тканини послідовно обробляють сумішшю розчину Triton х-100 і розчину дезоксихолату натрію, обробляють розчином лугу, обробляють розчином кислоти і хлориду натрію, ліофілізують, упаковують методом.
Матеріалом для отримання колагенових імплантатів можуть бути м'якоткані утворення сполучної тканини, такі як сухожилля, зв'язки, фасції, тверда мозкова оболонка, перикард, хрящі людини і тварин, наприклад свиней, корів, баранів і т.д.
Перед початком хімічної обробки фрагменти тканини необхідного розміру механічно очищають від м'яких оточуючих тканин і крові.
Як відомо, трансплантаційні антигени сполучної тканини зосереджені головним чином поверхні клітинних і базальних мембран. За своєю хімічною природою антигени, що містяться в сполучній тканині, є головним чином глікопротеїни, протеоглікани, сіалопротеїни, ліпопротеїни. Міжклітинна речовина, структурований колаген, має набагато нижчу видову специфічність у порівнянні з іншими білками організму. Таким чином, весь процес обробки спрямований на те, щоб видалити високоантигенні компоненти тканини і зберегти структуру колагену, який обумовлює механічні властивості імплантатів.
Для цього після механічного очищення матеріал обробляють сумішшю поверхнево-активних речовин (ПАР) 1% розчину Triton х-100 і 3% розчину дезоксихолату натрію в ультразвуковій ванні при температурі 30°С протягом 3-6 годин з дворазовою зміною розчину. Ця композиція ПАР найбільш ефективно видаляє з тканини клітини,залишки клітинних і базальних мембран, ліпопротеїни та жири, що омиляються, але можуть використовуватися і інші ПАР. Після обробки ПАР матеріал промивають проточною водою.
Після цього матеріал поміщають 0,1 М розчин гідроксиду натрію (NaOH). На даному етапі з матеріалу видаляють білки, розташовані на поверхні колагену, глікопротеїни, сіалопротеїни та глікозаміноглікани. Обробку проводять в ультразвуковій ванні протягом 10 годин при кімнатній температурі.
Потім матеріал обробляють розчином, що містить 1 М соляної кислоти (HCl) та 1 М хлориду натрію (NaCl) протягом 10 годин. Обробка кислотою дозволяє видалити з матеріалу залишки неколагенових кислоторозчинних білків, глікопротеїнів та глікозаміногліканів, нуклеїнові кислоти, а присутність солі дозволяє уникнути набухання колагену та прискорює вимивання неколагенових білків з матеріалу. Для більшої ефективності процес проводять в ультразвуковій ванні при кімнатній температурі.
Після обробки кислотою необхідно довести рН матеріалу до нейтрального та відмити від залишків розчинів. Для цього матеріал послідовно поміщають спочатку розчин, що містить 1 М NaCl і 0,1 М фосфатного буфера на 10 годин, потім промивають в 0,1 М розчині фосфатного буфера, а потім триразово промивають дистильованою водою.
Після закінчення хімічної обробки матеріал ліофілізують, упаковують та стерилізують радіаційним методом.
Приклад здійснення способу.
Тверду мозкову оболонку людини механічно очищають від супутніх м'яких тканин і крові і нарізають на фрагменти розміром 2×3 см. 100 г матеріалу поміщають в ультразвукову ванну, заливають 1 літром розчину, що містить 1% Triton x-100 і 3% дезоксихолату натрію. протягом 3 годин при температурі 30°Сдворазовою зміною розчину, розчин зливають, заготовки промивають у проточній воді, після чого заливають 1 літр 0,1 М розчину гідроксиду натрію (NaOH) і обробляють протягом 10 годин при кімнатній температурі, розчин зливають та фрагменти заливають 1 літром розчину, що містить 1М соляної кислоти (HCl) і 1 М хлориду натрію (NaCl), і обробляють протягом 10 годин при кімнатній температурі, зливають розчин і заливають 1 літр 0,1 М розчину фосфатного буфера з 1 М NaCl, обробляють при кімнатній температурі протягом 10 годин, потім промивають 1 літром 0,1 М розчину фосфатного буфера, після чого триразово промивають дистильованою водою.
Оброблений таким чином матеріал ліофілізують, упаковують та стерилізують радіаційним способом.
Приклад практичного застосування колагенового імплантату з твердої мозкової оболонки (тмо) як бар'єрну мембрану, отриману описаним способом.
Хворий К., 46 років, історії хвороби № 1365. Хворий звернувся до клініки МОНІКИ з приводу хронічного періодонтиту 37, відсутності 36 та 35. На рентгенограмі деструктивних змін кісткової тканини у проекції відсутніх 35, 36 та коренів 3. Запропоновано план лікування: дентальна імплантація за двоетапною методикою в сегментах 35 і 36, а також у сегменті 37 одномоментно з видаленням 37 та заміщенням кісткової порожнини демінералізованими кістковими чіпсами з перекриттям зони бар'єрною мембраною з тмо розміром 1,5 на 2 см. Перед операцією проведено -рентгенологічна та лабораторна діагностика, протипоказань до операції немає.
Хід операції: під місцевою анестезією розріз слизової оболонки альвеолярного гребеня в області відсутніх 35 і 36, навколо кореня 37 і додаткові вертикальні розрізи, відшаровані клапті, видалений 37, проведений ретельний кюретажлунки, туалет рани розчинами антисептиків, встановлені дентальні імплантати в сегментах 35 (4 на 13 мм), 36 (5 на 13 мм) та на місце віддаленого 37 (5 на 13 мм), де кісткові порожнини виконані демінералізованими кістковими чіпсами, змішаними попередньо розчином 30% лінкоміцину гідрохлориду, зона імплантації перекрита бар'єрною мембраною з тмо, попередньо замоченою на 20 хвилин у фізіологічному розчині та просоченою кров'ю пацієнта, клапті мобілізовані та фіксовані швами. У післяопераційному періоді проводилася антибактеріальна, протизапальна терапія, загоєння первинним натягом, суб'єктивно значних набряків та больового синдрому не відзначалося. Рентгенологічний контроль проведено після операції одразу, через 1, 3 та 5 місяців. Через 5 місяців після операції відзначено формування повноцінної кісткової тканини у зоні пластики, повна резорбція мембрани з тмо. Результат застосування мембрани з тмо при одномоментній дентальній імплантації слід визнати задовільним, а саме повна резорбція через 5 місяців та формування під нею повноцінної кісткової тканини.
Таким чином, використання запропонованого способу дозволяє отримати колагенові імплантати з високим ступенем біосумісності, які можна використовувати для оперативного лікування сухожильно-зв'язувального апарату та пошкоджень інших м'яких тканин, як бар'єрних мембран для відділення одного виду тканин від іншого, як носій клітин, лікарських засобів та біологічно активних речовин
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб виготовлення колагенових імплантатів, що включає механічне очищення, обробку розчином лугу, обробку розчином кислоти, консервацію і стерилізацію, який відрізняється тим, що в якості вихідного матеріалу використовують сухожилля, зв'язки, фасції,тверду мозкову оболонку, перикард, хрящі людини та тварин, заготовки обробляють сумішшю 1%-ного розчину Triton х-100 і 3%-ного розчину дезоксихолату натрію при температурі 30°С протягом 3-6 год з дворазовою зміною розчину, обробляють 0, 1М розчином гідроксиду натрію протягом 10 год, обробляють розчином, що містить 1М соляної кислоти і 1М хлориду натрію протягом 10 год, обробляють розчином, що містить 1М хлориду натрію і 0,1М фосфатного буфера протягом 10 год, пром , триразово промивають дистильованою водою.