Спосіб підготовки біоматеріалу для пцр діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби (вл крс)
Власники патенту UA 2566071:
Винахід відноситься до галузі ветеринарії. Запропоновано спосіб підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ПЛ ВРХ). Здійснюють взяття зразків крові тварини. Для підготовки до ПЛР діагностики використовують зразки біоматеріалу у вигляді клітинної культури СС81, культивованої на середовищі голки MEM у вигляді багатоядерних клітинних утворень - синтицій. Як негативний контроль використовують лейкоцити від тварини, негативної по ПЛ ВРХ, а також незаражену культуру. Досягається підвищення точності виявлення ПЛ ВРХ за допомогою ПЛР за рахунок особливостей клітинної лінії фібробластів легкої кішки СС81 формувати синцитії за наявності у зразках вірусу. 2 іл., 1 ін.
Винахід відноситься до галузі ветеринарії та вірусології, зокрема до методів лабораторної діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ПЛ ВРХ).
Лейкоз ВРХ - злоякісне вірусне лімфопроліферативне захворювання. Ретровірус ПЛ ВРХ, що відноситься до сімейства Retroviridae, роду Deltaretrovirus, інтегрується в ДНК лейкоцитів господаря і перебуває в латентному стані у великій кількості клітин протягом тривалого періоду часу, що ускладнює його визначення та виявлення хворих тварин.
Відомі різні діагностичні методи для тестування зразків крові ВРХ на наявність вірусу ПЛ ВРХ, зокрема і серологічні методи (РІД, ІФА), та метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Однак за допомогою серологічних методів неможливо виявити ПЛ ВРХ на ранніх стадіях інфекції, що особливо важливо для своєчасної ізоляції здорових телят від ПЛ ВРХ інфікованих тварин. ПЛР є більш чутливим методом, але при низькому навантаженні провірусу ПЛ ВРХ на початкових стадіяхзахворювання цей метод не завжди ефективний (див. патенти України №2377962; 2379683; 2445370).
Известен также синцитиальный тест, который используется для исследований вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) в Научно-исследовательском Ветеринарном Институте в Пулавы, Польша (Jan Stec, Leokadia Bicka, Bozenna Kozaczynska, Jacek Kuzmak. Lymphoproliferation assay in cattle naturally infected with bovine leukemia virus (BLV) and bovine immunodeficiency virus (BIV). Bulletin of Veterinary Institute. Однак цей метод має низку недоліків. По-перше, при найменшому порушенні стерильності можлива контамінація зразків, тим більше якщо в одному культуральному планшеті їх знаходиться кілька. Крім того, у зв'язку з тим, що культура клітин СС81 чутлива до кількох вірусів сімейства Retroviridae, для підтвердження діагнозу на ПЛ ВРХ інфекцію за методикою необхідно проводити контрольний імунопероксидазний тест, що вимагає додаткових маніпуляцій, часу та дорогих витратних матеріалів та розчинів (за загального часу діагностики 10-11 діб).
Завданням винаходу є створення способу підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що дозволяє визначити наявність ПЛ ВРХ у зразках крові телят на ранніх стадіях інфекції та проводити діагностику з використанням існуючої серійної апаратури та тест-систем і не потребує додаткового спеціального навчання діагностичних лабораторій при скороченні загального часу постановки діагнозу, здатного виявляти захворювання у телят із 15-30 денного віку.
Поставлене завдання вирішується за рахунок особливостей клітинної лінії фібробластів легкої кішки СС81 формувати синцитій за наявності у зразках вірусуВЛ ВРХ, збільшуючи копійність вірусу за рахунок реплікації віріону в досліджуваних зразках для підвищення точності виявлення вірусу за допомогою ПЛР, при цьому спосіб підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛ ВРХ), що включає взяття зразків крові тварини, підготовку образ і діагностику підготовленого зразка, характеризується тим, що для підготовки до ПЛР діагностики використовують зразки біоматеріалу у вигляді клітинної культури СС81, культивованої на середовищі Голка MEM у вигляді багатоядерних клітинних утворень - синтицій, при цьому для культивування клітин СС81 використовують живильне середовище. глутаміном і подвійним набором амінокислот з додаванням ембріональної телячої сироватки, причому концентрація сироватки в поживному середовищі дорівнює 10%, а для стерилізації сироватки використовують прогрівання при температурі 56°C протягом 30 хвилин, причому культуру культивують в пластик зміною середовища 3 рази на тиждень, а при зараженні СС81 в середу. глутамін, при цьому як негативний контроль використовують лейкоцити від тварини, негативної по ПЛ ВРХ, а також незаражену культуру.
Запропонований спосіб підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби заснований на відомих спостереженнях аргентинського вченого Ferrer J.F., який описав здатність культури клітин до утворення синцитію під впливом вірусу ПЛ ВРХ (див. Ferrer J.F., Piper С.Е., Mart. RR Diagnosis of bovine leukemia virus infection: evaluation of serologic and hematologic tests by aDirect infectivity detection assay. American Journal of Veterinary Research, 1997; Дек. 38 (12): 1977-81).
Розроблений спосіб виявлення ПЛ ВРХ за допомогою культури клітин СС81 на відміну від прототипу включає ряд істотних змін, що є новизною винаходу.
На відміну від методики, яка послужила прототипом для даного винаходу, подальшу концентрацію ембріональної сироватки ВРХ у середовищі знижують до 6% та 2%, замість 8% та 6% (через 2 та 4 дні після зараження відповідно). За спостереженнями використовувані концентрації сироватки позитивно впливають на зараження клітинної культури вірусом, що, ймовірно, міститься в лейкоцитах ПЛ ВРХ позитивної тварини.
Також новизною є те, що замість витратного за часом та економічно невигідного пероксидазного тесту для підтвердження наявності вірусу ПЛ ВРХ у зразках з утворенням синцитію у способі використовується додатковий уточнюючий тест клітинної культури у 7-й день після зараження методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Більш детально проведення синцитіального тесту описується в наступній послідовності у наведеному прикладі:
Попередньо готують клітинну культуру СС81, розкопують по 2 мл на лунку в 12-лункову плашку і інкубують протягом 2-х днів при 37°C СО2-термостаті. Через 2 діб у сформований моношар СС81 додають лейкоцитарну суспензію, отриману із зразків крові досліджуваних ВРХ наступним чином:
Паралельно з підготовкою клітинної культури СС81 у тварин із підозрою на лейкоз проводять забір крові у вакуумні пробірки з ЕДТА об'ємом 10 мл. Взяту кров центрифугують при 2600 об/хв протягом 30 хв. Далі потрібно видалити піпеткою супернатант і зібрати інтерфазу світлого кольору на межі плазми та еритроцитів,містить лейкоцити. До цієї рідини додають 4 мл стерильної дистильованої холодної води, охолодженої до температури 4-8°C, перемішують протягом 30 сек і додають 1 мл стерильного 4,5% хлориду натрію з подальшим перемішуванням. Після цього центрифугування повторюють при 2600 об/хв протягом 30 хв. Піпеткою видаляють супернатант та ресуспендують осад у 8 мл стерильного фосфатного буфера. Проводять центрифугування при 1500 об/хв протягом 15 хв. Видаляють супернатант та повторно промивають осад шляхом додавання 8 мл фосфатного буфера, сильно збовтують. Ще раз центрифугують при 1500 об/хв протягом 15 хв. Отриману лейкоцитарну суспензію ресуспендують у 6 мл 10% середовища з додаванням 3-х антибіотиків: пеніцилін, стрептоміцин (по 100 ОД (мкг/см 3 ), амфотерицин (5 ОД/мл) і глутаміну В при етапі центрифугування проводять. Як позитивний контроль використовують лейкоцити від тварини, позитивної за ПЛ ВРХ, як негативний контроль використовують лейкоцити від тварини, негативної за ПЛ ВРХ, а також незаражену культуру. -Денний моношар (по три лунки на кожну пробу) (фіг. 1).
Приготування фосфатного буфера (без Са++ та Mg++), який використовується для отримання лейкоцитарної суспензії, проводять наступним чином:
Вода редистилят - до 500 мл
Підрахунок кількості лейкоцитів виробляють у камері Горяєва. Для зараження моношару СС81 необхідна наявність не менше 5×10 6 клітин на 1 мл середовища.
Через 2 та 4 дні після зараження культури середовище з лунок видаляють і додають свіже середовище з концентрацією сироватки 6% та 2% відповідно. На фіг. 2А зображено моношар СС81 через 2 дніпісля додавання живильного середовища, що містить лейкоцити від ПЛ ВРХ позитивного барана. У 7-й день після зараження культури клітини триразово промивають фосфатним буфером і забарвлюють за методом Ґрунвальда-Гімза таким чином:
Розчин Ґрунвальду додають на 3 хвилини, при цьому лунки мають бути повністю вкриті рідиною. Далі розчин Ґрунвальду акуратно видаляють дозатором і кілька разів промивають клітини дистильованою водою. Потім додають на 15 хвилин свіжий розчин гімзу (готовлять з розрахунку 1,5 мл розчину і 23,5 мл дистильованої води). Після цього планшет обережно промивають водою. Забарвлену клітинну культуру досліджують мікроскопом. ЦПД, викликане ПЛ ВРХ, спостерігають у вигляді синцитії - багатоядерних клітинних утворень (фіг. 2, В, Г). Моношар інтактної клітинної культури СС81 як негативний контроль зображений на фіг. 2Б. Далі отриману клітинну культуру направляють на ПЛР діагностику.
На фіг. 1. Наведено схематичне зображення 12-лункового культурального планшета, що містить 2-денний моношар СС81 після додавання 10% середовища Голка MEM (див. вище) у вигляді 12 рожевих гуртків. Маленькі жовті кружки зображують лейкоцити. Лунки A1, В1, С1: у середу додано лейкоцитарну суспензію від негативної тварини по ВЛКРС (негативний контроль); лунки А2, В2, С2: у середу додано лейкоцитарну суспензію від досліджуваної тварини; лунки A3, В3, С3: у середу додано лейкоцитарну суспензію від позитивної по ПЛ ВРХ тварини (позитивний контроль); лунки А4, В4, С4: незаряджений моношар як додатковий негативний контроль.
На фіг. 2 представлені зображення клітинної культури СС81, одержані на інвертованому мікроскопі Карл Цейс Axio Observer A1. А: моношар клітинної культури СС81 через 2діб після додавання 10% середовища (дивіться вище), що містить лейкоцити, отримані з крові барана, позитивного за ПЛ ВРХ. Лейкоцити відмічені стрілками; Б: моношар незараженої культури СС81 у 7-й день синцитіального тесту. В, Г: приклади утворення синцитіїв у моношарі клітинної культури СС81 на 7-й день після зараження лейкоцитами від ПЛ ВРХ позитивного барана. Стрілки вказують на утворення синцитіїв, що містять 4 ядра (В) та 5 ядер (Г) відповідно. Клітинну культуру забарвлювали методом Ґрунвальда-Гімза. Ядра та цитоплазма пофарбовані в рожевий та фіолетовий колір відповідно.
Досліди щодо відпрацювання параметрів запропонованого способу проводили на базі відділу моніторингу та прогнозування інфекційних захворювань тварин ФДБНУ «Уральський науково-дослідний ветеринарний інститут» м. Єкатеринбург. Запропонований спосіб апробований з позитивними результатами та регулярною відтворюваністю на пробах та зразках крові, отриманих з неблагополучних господарств Свердловської, Курганської та Тюменської областей Уральського федерального округу, включаючи діагностику зразків крові телят віком від 15 днів до 3 місяців, що шляхом інших діагностичних методик раніше зробити практично неможливо.
Вторинні ознаки способу - як використання в якості добавки разом з лейкоцитами пеніциліну, стрептоміцину (по 100 ОД (мкг/см 3 )), амфотерицину (5 ОД/мл) і глутаміну, концентрація ембріональної сироватки в поживному середовищі 10%, ознаки, визначені та обґрунтовані практично досвідченим шляхом та забезпечують заявлений кінцевий результат.
Впровадження запропонованого способу, який можна вважати ранньою діагностикою збудника лейкозу на основі ПЛР, дозволить визначити вірусоносії у молодняку великої рогатої худоби вже з віку15-20 днів.
Розроблена рання діагностика лейкозу дозволить підвищити ефективність оздоровлення сільськогосподарських підприємств від інфекції.
Неочевидним ефектом запропонованого способу є те, що за рахунок підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики за запропонованою схемою з вирощуванням культури клітин СС81 на середовищі Голка MEM при заданих параметрах збільшується копійність вірусу, що підвищує ефективність ПЛР діагностики та дозволяє виявляти вірусоносії серед телят5 ембріон -30 днів, знижуючи витрати на оздоровлення стада.
Спосіб підготовки біоматеріалу для ПЛР діагностики вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ПЛ ВРХ), що включає взяття зразків крові тварини, підготовку зразка для досліджень і діагностику підготовленого зразка, що характеризується тим, що для підготовки до ПЛР діагностики використовують зразки біоматеріалу у вигляді клітинної культури СС8 на середовищі Голка MEM у вигляді багатоядерних клітинних утворень - синтицій, при цьому для культивування клітин СС81 використовують живильне середовище Голка MEM з L-глутаміном і подвійним набором амінокислот з додаванням ембріональної телячої сироватки, причому концентрація сироватки сироватки використовують прогрівання при температурі 56°C протягом 30 хвилин, причому культуру культивують у пластикових флаконах при температурі 37°C з повною зміною середовища 3 рази на тиждень, а при зараженні СС81 в середу Голка MEM з 10% ембріональної сироваткою ВРХ разом з додають три антибіотики: пеніцилін 100 ОД/см 3 , стрептоміцин 100 мкг/см 3 , амфотерицин 5 ОД/мл, а також глутамін, при цьому як негативний контроль використовують лейкоцити від тварини, негативної по ПЛ ВРХ, а також незараженукультуру.