Спосіб визначення активності алкогольдегідрогенази
Використання: в експериментальній біології, в медицині та біохімії. Сутність винаходу: гомогенат готують печінки і визначають активність алкогольдегідрогенази в присутності іонів Ca 2+ в концентрації 10 -4 M. 4 табл.
Винахід відноситься до експериментальної біології та медицини, біохімії та може бути використане для визначення активності алкогольдегідрогенази (АДГ).
Дослідженню активності алкогольдегідрогенази в тканинах надають великого значення для оцінки механізмів толерантності та характеристики фармакодинаміки етанолу в організмі. Існуючі в даний час методи визначення активності ферменту недостатньо точні через наявність інгібіторів АДГ, що підтверджено в дослідженнях. Тому в дослідженнях постає завдання підвищення точності визначення активності АДГ у тканині без впливу природних інгібіторів ферменту, присутніх у тканині.
За прототип винаходу обрано метод визначення активності алкогольдегідрогенази в тканині. Активність ферменту визначається серед наступного складу: 2,7 мл (0,1 М Гліцин-NaOH буфер, рН 9,0). 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М етанол); 0,1 мл гомогенату тканини. Активність ферменту виражали нмоль НАДН/хв на мг білка. Однак цей спосіб має суттєвий недолік. Він не враховує наявність інгібуючого ефекту на алкогольдегідрогеназу у тканині. В результаті активність ферменту при визначенні виходить заниженою, що не дає змоги правильно оцінити реальні можливості ферментативної системи метаболізму етанолу.
Технічним результатом винаходу є підвищення точності визначення активності алкогольдегідрогенази в тканині.
Технічний результат способу визначення активності АДГ, що включає взяття печінки, приготування гомогенату, визначення в ньомуактивності ферменту метаболізму алкоголю, що досягається тим, що визначення активності алкогольдегідрогенази проводять у присутності іонів Са 2+ для усунення впливу інгібіторів на фермент.
Визначення активності алкогольдегідрогенази запропонованим способом раніше ніде не використовувалося. В експерименті було встановлено, що в присутності іонів Са 2+ вплив ендогенних інгібіторів на АДГ усувається, що дозволяє визначити реальну активність ферменту тканини.
Таким чином, на основі експериментальних досліджень про вплив іонів Са 2+ на активність АДГ розроблено спосіб визначення активності алкогольдегідрогенази у тканині. Позитивний ефект пропонованого способу полягає у підвищенні точності визначення активності алкогольдегідрогенази на 42% до в результаті визначення активності ферменту в тканині в присутності іонів Са 2+ .
Пропонований спосіб здійснюється наступним чином. Експериментальну тварину (щур) умертвляють декапітацією. Вилучають печінку і готують гомогенат серед наступного складу (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН-7,4) у співвідношенні 1 г тканини + 9,0 мл середовища. Отриманий гомогенат розводять середовищем виділення в 5 разів і беруть 0,1 мл визначення активності АДГ. Визначення активності ферменту проводять серед наступного складу: 2,6 мл (0,1 М Гліцин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М етанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl2); 0,1 мл гомогенату. Активність ферменту виражали нмоль НАДН/хв на мг білка, розраховуючи за формулою Активність де Е зміна оптичної щільності проби за 1 хв; кінцевий обсяг проби в кюветі 3,0 мл; 6,22 10 -3 коефіцієнт наномолекулярної екстинкції відновленої форми піридинових нуклеотидів при довжині хвилі 340 нм; Т час 1 хв; А кількість білка в пробі визначена методом Лоурі,мг.
П р і м е р. Тварина (щур, N 10, 150 г) умертвляють декапітацією. Вилучають печінку і готують гомогенат серед наступного складу (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) у співвідношенні 1 г тканини + 9,0 мл середовища. Отриманий гомогенат розводять середовищем виділення в 5 разів і беруть 0,1 мл визначення активності АДГ. Визначення активності ферменту проводять у середовищі наступного складу: 2,6 мл (0,1 М Гліцин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М етанол); 0,1 мл (0,001 М СаСl2); 0,1 мл гомогенату. Активність ферменту виражають у нмоль НАДН/хв на мг білка, розраховуючи за формулою, описаною вище.
Отримані результати визначення активності АДГ представлені у табл. 1.
Точність визначення активності АДГ у запропонованому способі на 42% вище, ніж у прототипі.
П р і м е р 2. Тварина (щур, N 14, 158 г) умертвляють декапітацією. Вилучають печінку і готують гомогенат серед наступного складу (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) у співвідношенні 1 г тканини + 9,0 мл середовища. Отриманий гомогенат розводять середовищем виділення в 5 разів і беруть 0,1 мл визначення активності АДГ. Визначення активності ферменту проводять серед наступного складу: 2,6 мл (0,1 М гліцин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М етанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl2); 0,1 мл гомогенату. Активність ферменту виражають у нмоль НАДН/хв на мг білка, розраховуючи за формулою, описаною вище.
Отримані результати визначення активності АДГ представлені у табл. 2.
Точність визначення активності АДГ у запропонованому способі на 45% вище, ніж у прототипі.
П р і м е р 3. Тварина (щур, N 19, 140 г) умертвляють декапітацією. Вилучають печінку і готують гомогенат в наступному складі (0,25 М сахароза, трис-НСl, рН 7,4) у співвідношенні 1 г тканини + 9,0мл середовища. Отриманий гомогенат розводять середовищем виділення в 5 разів і беруть 0,1 мл визначення активності АДГ. Визначення активності ферменту проводять серед наступного складу: 2,6 мл (0,1 М Гліцин-NaOH буфер, рН 9,0); 0,1 мл (0,04 М НАД); 0,1 мл (0,75 М етанол); 0,1 мл (0,001 М CaCl2); 0,1 мл гомогенату. Активність ферменту виражають у нмоль НАДН/хв на мг білка, розраховуючи за формулою, описаною вище.
Отримані результати визначення активності АДГ представлені у табл.3.
Точність визначення активності АДГ у запропонованому способі на 43% вище, ніж у прототипі. Зведені результати дослідження визначення активності алкогольдегідрогенази представлені в табл. 4.
Проведені дослідження показали, що точність визначення активності алкогольдегідрогенази у тканині, запропонованим способом, підвищується на 42% порівняно з прототипом.
СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ АЛКОГОЛЬДЕГІДРОГЕНАЗИ, що включає взяття печінки, приготування гомогенату, визначення активності ферменту в інкубаційному середовищі, який відрізняється тим, що активність алкогольдегідрогенази в тканині визначають у присутності хлористого 0 кальцію.