Спосіб визначення патогенності мікроорганізмів, Банк патентів
Винахід відноситься до галузі медицини та стосується способу визначення патогенності мікроорганізму Staphylococcus epidermidis. Сутність винаходу полягає в інкубації дослідних проб. Виділених від донорів з лактоферрином у концентрації 320-580 нг/мл з подальшим встановленням кількості мікроорганізмів, що вижили, порівняно з контролем. Перевага винаходу полягає у підвищенні чутливості способу. 1 табл.
Винахід відноситься до галузі медицини, а саме клінічної лабораторної діагностики і може бути використане, зокрема, для визначення етіологічної ролі мікроорганізмів в інфекційній патології.
У практичній медицині відомо кілька способів визначення патогенності виділених мікроорганізмів. Зокрема, визначення таких факторів патогенності, як адгезивної активності бактерій, цитолітичної та гемолітичної активностей, продукція ними протеази, гіалуронідази, а також деградація бактеріями таких факторів неспецифічної резистентності організму, як лізоцим, комплемент та інтерферон. ред.. М. О. Біргера.- 3-е вид., перероблене і доповнене.- М.: Медицина, 1982, с.117;Стейнієр Р., Едельберг Е., Інгрем Дж. Світ мікробів. - М: Мир, 1979, с.365-397).
Під патогенністю бактерій розуміють здатність викликати захворювання. Це видова полідетермінантна ознака збудника, що позначає його потенційну можливість викликати інфекційний процес, тобто проникати в організм, розмножуватися в ньому і чинити на нього шкідливу дію. Основні фактори патогенності поділяють на три групи:
1. Фактори, що визначають взаємодію мікроорганізму з епітеліємслизових оболонок.
2. Фактори, що сприяють стійкості мікроорганізму до гуморальних та клітинних факторів захисту макроорганізму та здатності розмножуватися in vivo.
3. Здатність продукувати токсини та токсичні продукти, викликаючи власне патологічний процес.
Важливою фазою інфекційного процесу є взаємодія мікроба з клітинними та гуморальними механізмами господаря та забезпечення розмноження in vivo. Патогенні та умовно-патогенні бактерії використовують для цього різноманітні механізми захисту. Так джгутики рухливих бактерій перешкоджають їхньому контакту з фагоцитами. Бактерії можуть продукувати фактори, що пригнічують міграцію лейкоцитів до місця інфекції або пригнічують поглинання бактерій. У багатьох бактерій існують структури, що забезпечують їхнє виживання та розмноження всередині фагоцитів. Ці структури сприяють стійкості мікроорганізму до активності, що перетравлює фаголізосом або перешкоджають злиттю фагосом з лізосомами. У той же час резистентність до бактерицидної дії нормальної сироватки у клебсієл, наприклад, обумовлюється наявністю білків зовнішньої мембрани ліпополісахаридів і кислих полісахаридів К-антигена. Також до факторів патогенності відносять адгезиві та цитотоксичні властивості бактерій (пили, екзо- та ендотоксини, ферментативні фактори).
Цей спосіб має такі недоліки.
Спосіб не дозволяє зробити досить достовірний висновок про потенційну патогенність того чи іншого штаму, тому що якщо в слинній та слізній рідині лізоцим є одним з основних антимікробних агентів, то в інших середовищах людського організму його концентрація істотно нижча і наявність цієї властивості у мікроорганізму ще не забезпечує його носію достатньої стійкості та здатності викликати інфекційнийпроцес. Крім того, коливання його рівня при розвитку тих чи інших нозоформ практично не вивчено. Навпаки, підвищення рівня лактоферин в організмі при сепсисі, пневмонії та інших інфекційних захворюваннях є встановленим фактом і, отже, стійкість мікроорганізму до цього фактора неспецифічного імунітету дозволить йому успішно розмножуватися in vivo.
Спосіб вимагає для кількісного визначення антилізоцимної активності використання тест-культури Micrococcus lysodeicticus та, як наслідок, додаткових маніпуляцій та реактивів для її підготовки.
Спосіб заснований на методі відстроченого антагонізму і тому збільшує час аналізу на додаткові 24 години для попереднього вирощування досліджуваної культури.
Метою представленого винаходу є збільшення чутливості, точності, скорочення часу, необхідного для встановлення патогенності виділеного штаму при одночасної простоті та доступності запропонованого способу для широкого практичного застосування.
Поставлена мета у винаході досягається тим, що в якості маркера використовують лактоферин, взятий у концентрації 320 - 580 нг/мл з подальшим встановленням кількості мікроорганізмів, що вижили порівнянням оптичної щільності досвіду і контролю.
Таким чином, перевага пропонованого способу в тому, що встановлення шкідливого впливу лактоферину на виділені мікроорганізми підвищує достовірність визначення їх патогенності. Так як проводиться визначення прямої ушкоджуючої дії лактоферину на бактеріальну клітину, час аналізу після отримання чистої культури становить 3,5 год, що на 44 години швидше, ніж прототип.
Крім того, застосуванням для кількісного визначення числа бактерій, що вижили клітин.після інкубації з лактоферрином фотоелектрокалориметра (КФК-2) робить запропоновану методику більш чутливою, ніж досягається більш висока точність та відтворюваність результатів.
Спосіб доступний для широкого практичного використання завдяки відносно низькій собівартості та простоті виконання.
Запропонований спосіб був успішно апробований на 100 зразках у практичній роботі кафедри загальної та біоорганічної хімії Астраханської державної медичної академії протягом 2002 року.
Нижче наведено результати апробації.
Визначали стійкість до шкідливої дії лактоферину Staphylococcus epidermidis, що має типові біохімічні, морфологічні та культуральні характеристики та виділеного зі сперми здорового донора С-ва.
В одну пробірку поміщали 0,2 мл лактоферину, взятого в концентрації 0,8 мкг/мл (досвід), і в другу - 0,2 мл 0,5% хлориду розчину натрію - контроль. Потім контрольну і дослідну пробірки вносили по 0,1 мл суспензії досліджуваної культури в концентрації 10 20 мк/мл. Кінцева концентрація ЛФ у досліді становила 320 нг/мл.
У цьому варіанті ОП досвіду нижче за контрольну на 70% (тобто становила 30%). З отриманих результатів робиться висновок про відсутність патогенного потенціалу у даного штаму Staphylococcus epidermidis (Таблиця 1).
Визначали стійкість до шкідливої дії лактоферину Staphylococcus epidermidis, що має типові біохімічні, морфологічні та культуральні характеристики та виділеного із сперми пацієнта Г-ко з хронічним простатитом.
В одну пробірку поміщали 0,2 мл лактоферину, взятого в концентрації 0,8 мкг/мл (досвід), і в другу - 0,2 мл 0,5% хлориду розчину натрію - контроль. Потім у контрольну та дослідну пробірки вносили по 0,3 мл.суспензії досліджуваної культури в концентрації 10 20 мк/мл. Кінцева концентрація ЛФ у досліді становила 400 нг/мл.
Далі дослідження проводили способом, описаним у прикладі №1.
У цьому прикладі ОП досвіду перевищувала контрольну на 40% (тобто становила 140%). Виходячи з отриманих результатів робиться висновок про патогенність даного штаму Staphylococcus epidermidis та його значущість в етіології простатиту (Таблиця 1).
Визначали стійкість до шкідливої дії лактоферину Staphylococcus epidermidis, що має типові біохімічні, морфологічні та культуральні характеристики і виділеного з ранового пацієнта, що відокремлюється Н-а.
В одну пробірку поміщали 0,2 мл лактоферину, взятого в концентрації 0,8 мкг/мл (досвід), і в другу - 0,2 мл 0,5% хлориду розчину натрію - контроль. Потім контрольну і дослідну пробірки вносили по 0,4 мл суспензії досліджуваної культури в концентрації 10 20 мк/мл. Кінцева концентрація ЛФ у досліді становила 580 нг/мл.
Далі дослідження проводили способом, описаним у прикладі №1.
І тут ВП досвіду перевищує контрольну на 20% (тобто становила 120%). Виходячи з отриманих результатів робиться висновок про патогенність даного штаму Staphylococcus epidermidis та його значущість в етіології ранової інфекції (Таблиця 1).
Пропонованим способом досягається позитивний ефект: підвищується ефективність визначення патогенності мікроорганізмів за рахунок використання як маркер їх стійкості до лактоферину, підвищується чутливість, точність проведення аналізу при одночасному використанні недорогого обладнання та реактивів, простоті та доступності для широкого практичного застосування, скорочується число стадій порівняно з прототипом і як наслідок цього скорочується час,необхідне видачі укладання лабораторії на 44 год.
Проведення дослідження розширить можливості встановлення етіології інфекційного процесу різної локалізації.
Пропонований спосіб може бути використаний у фундаментальній та практичній медицині для визначення патогенності мікроорганізмів.
| Таблиця 1 Відтворюваність результатів визначення патогенності мікроорганізмів пропонованим способом | |||||
| приклад | Концентрація лактоферину, нг/мл | ВП контроль | ВП досвід | %ОП досвіду від контролю | Патогенність виділених мікроорганізмів |
| 1 | 320,0 | 0,05 | 0,015 | 30,0 | Чи не патогенний |
| 2 | 400,0 | 0,1 | 0,120 | 120,0 | Патогенний |
| 3 | 580,0 | 0,2 | 0,280 | 140,0 | Патогенний |
формула винаходу
Спосіб визначення патогенності мікроорганізмів Staphylococcus epidermidis, що характеризується тим, що дослідні проби мікроорганізмів, виділені від донорів, інкубують з лактоферрином в концентрації 320-580 нг/мл з подальшим встановленням кількості вижили мікроорганізмів порівнянням оптичної щільності досвіду і контролю контролем вважають цей штам патогенним.
MM4A Дострокове припинення дії патенту України на винахід через несплату у встановлений термін мита за підтримку патенту в силі