Техніка посівів на щільні та рідкі живильні середовища
1. При посіві в рідке живильне середовище петлю з матеріалом, що знаходиться на ній, занурюють у середу. Якщо в'язкий матеріал і з петлі не знімається, його розтирають на стінці судини, а потім змивають рідким середовищем. Рідкий матеріал, що набирається в пастерівську або градуйовану піпетку, вливають у живильне середовище.
2. При сівбі на скошений м'ясо-пептонний агар пробірку беруть у ліву руку між I і II пальцями, щоб підстава пробірки знаходилася на поверхні кисті руки та посів здійснювався під контролем ока. Пробку з пробірки виймають правою рукою V і IV пальцями, не торкаючись тієї частини пробки, яка входить усередину пробірки. Інші 3 пальці правої руки залишаються вільними для взяття бактеріальної петлі, за допомогою якої проводиться посів. Петлю тримають, як перо письма. Після виймання пробки пробірку з живильним середовищем тримають у похилому положенні, щоб уникнути потрапляння до неї сторонніх мікроорганізмів з повітря.
Петлю з пересіваним матеріалом, що знаходиться на ній, вводять у пробірку до дна, опускають полум'я на поверхню живильного середовища і ковзними рухами наносять штрих знизу вгору, від однієї стінки пробірки до іншої (рис. 4).
3. При посіві на поверхню щільного живильного середовища чашки Петрі чашку тримають у лівій руці. Дно її з одного боку притримують І і ІІ пальцями, з другого — IV і V пальцями. Кришку, відкриту настільки, щоб у щілину, що утворилася, вільно проходили петля або шпатель, фіксують I і III або I і II пальцями. Невелика кількість досліджуваного матеріалу втирають бактеріальною петлею у поверхню живильного середовища біля краю чашки (рис. 5). Потім петлю пропалюють, щоб знищити надлишок матеріалу, що знаходиться на ній. Лінію посіву починають із того місця, в якому знаходиться матеріал.Бактеріальну петлю кладуть полум'я на живильне середовище, щоб не подряпати її поверхні, і проводять штрихи по всьому середовищу або по секторах, попередньо розграфивши дно чашки (за умови, що середовище прозоре) на кілька рівних частин. Потрібно намагатися, щоб штрихи, що наносяться петлею, розташовувалися якомога ближче один до одного, оскільки це подовжує загальну лінію посіву і дає змогу отримати ізольовані колонії мікроорганізмів.
Мал. 5. Посів на щільне живильне середовище у чашки Петрі
Для рівномірного розподілу матеріалу, що засівається, по поверхні щільного живильного середовища можна користуватися замість петлі тампоном або шпателем.
При великій кількості в матеріалі, що засівається мікробів вони ростуть у вигляді плівки, що покриває всю поверхню живильного середовища. Такий характер мікробного зростання отримав назву суцільного, або газонного. Посів газоном виробляють, коли потрібно отримати велику кількість мікробної культури одного виду.
4. З матеріалу, що підлягає посіву в товщу щільного живильного середовища, готують завись у стерильній водопровідній воді або в ізотонічному розчині. Набирають 0,1-1 мл суспензії в піпетку (залежно від ступеня передбачуваного мікробного забруднення) і виливають у порожню стерильну чашку Петрі. Слідом за цим чашку заливають 15-20 мл м'ясо-пептонного агару, розплавленого і остудженого до температури 40-45 ° С (при такій температурі пробірка з середовищем, прикладена до щоки, не повинна викликати відчуття опіку). Для рівномірного розподілу досліджуваного матеріалу в живильному середовищі закриту чашку з вмістом злегка обертають поверхнею столу.
5. Посів уколом у стовпчик живильного середовища проводять у пробірку із середовищем, що застигло у вигляді стовпчика. Пробірку беруть у ліву руку, як завжди, і в центрістовпчика до дна пробірки працюють петлю з матеріалом, що знаходиться на ній.
Отримання чистих культур
Чистою культурою мікробів називають популяцію мікроорганізмів одного виду, отриману із ізольованої мікробної колонії. Під мікробною колонією мається на увазі потомство бактерій, що виникає внаслідок розмноження однієї мікробної клітини.
Виділення чистої культури бактерій є обов'язковим етапом будь-якого бактеріологічного дослідження. Чиста культура необхідна вивчення морфологічних, культур культуральних, біохімічних і антигенних властивостей, за сукупністю яких визначається видова приналежність досліджуваного мікроорганізму.
Для виділення чистих культур бактерій з матеріалів, що містять велику змішану мікрофлору, запропоновано багато різних способів. Найбільшого поширення набув метод механічного роз'єднання мікроорганізмів, що у досліджуваному матеріалі, з одержання ізольованих колоній лежить на поверхні чи глибині живильного середовища.
Дуже широко застосовуються елективні живильні середовища, що стимулюють розвиток тих мікроорганізмів, чисту культуру яких передбачається виділити.
Деякі види мікробів мають високу чутливість до впливу певних факторів зовнішнього середовища. Індивідуальна стійкість мікробів до того чи іншого фактора була використана для розробки методів виділення чистих культур шляхом умертвіння супутньої мікрофлори. Цим способом проводиться виділення спорових форм мікробів, стійких до дії високої температури, мікобактерій туберкульозу, байдужих до дії концентрованих розчинів мінеральних кислот, на відміну від інших мікробів, що містяться у харкотинні.
Для виділення бактерій у вигляді чистих культурвідомо порівняно мало методів. Найчастіше це роблять шляхом ізолювання окремих клітин на твердому поживному середовищі, використовуючи метод посіву штрихом або розливу чашками невеликої кількості рідкої культури. Однак отримання окремої колонії не завжди гарантує чистоту культури, оскільки колонії можуть зрости не тільки з окремих клітин, але з їх скупчень. Якщо мікроорганізми утворюють слиз, до неї часто прикріплюються сторонні форми. У разі виділення штамівBacillusабо актиноміцетів контамінуючі мікроорганізми можуть бути обплутані ланцюжками клітин або, відповідно, гіфами цих мікробів. Для очищення краще використовувати неселективне середовище, оскільки на ньому краще ростуть мікроорганізми, що контамінують, і їх легше виявити. Але навіть на неселективному середовищі не слід дуже швидко відбирати колонії, оскільки за даний відрізок часу можуть не вирости бактерії, що повільно ростуть.
З чистої культури зазвичай виростають однакові колонії і при мікроскопуванні виявляються схожі клітини, зокрема, за розміром та забарвленням за Грамом. Однак можливі винятки, наприклад, колонії, що виростають із чистої культури, можуть бути гладкі (S) і шорсткі (R). Крім того, у чистих культурах різних мікроорганізмів можуть з'явитися коккоподібні клітини, цисти та суперечки. Нарешті, деякі мікроорганізми виявляють грамваріабельність. Проте, зазначені критерії широко використовуються щодо чистоти культур.
Посів штрихом
Існує багато методів посіву штрихом у чашки з твердими середовищами («штриховані чашки»), але лише деякі з них майже завжди дають ізольовані колонії навіть за відсутності навичок експериментатора. Крім того, можна наливати розведені розчини змішаноїкультури на поверхню твердих середовищ у чашках. При роботі з анаеробами «штриховані чашки» або чашки із внесеною в них рідкою культурою в атмосфері повітря потім інкубують в анаеростаті. Для анаеробів необхідні свіжоприготовлені середовища, і посів штрихом слід проводити протягом перших 4 годин після їх автоклавування, щоб уникнути накопичення розчиненого кисню.
ВГД
Мал. 6. Зручний метод посіву штрихом чашки для отримання окремих колоній. А. Для маркування на звороті чашки Петрі олівцем наносять букву Т, що розділяє дно на 3 сектори. Б. Петлею з культурою зигзагом наносять штрихи на поверхні агару в секторі 1, як показано на малюнку. Для цього кришку чашки спочатку піднімають, а після нанесення штриха одразу закривають. Петлю стерилізують у полум'ї та дають їй охолонути (15 с). Проводять петлею по поверхні середовища в секторі 1, як показано на малюнку, і потім негайно наносять нею зигзагом штрихи на поверхні середовища в секторі 2. Прогрівають петлю в полум'ї і дають їй охолонути. Г. Проводять петлею по поверхні середовища в секторі 2, як показано, і потім наносять нею зигзагом штрихи на поверхні середовища в секторі 3. Д. Інкубують перекинуті догори дном чашки, як показано на малюнку, для того, щоб вода, що конденсується, з кришки не потрапила на поверхню агару. У секторі 1 виростає велика кількість колоній, тоді як у секторах 2 та 3 з'являються окремі добре ізольовані колонії.