ТЕХНІКА ПОСІВУ, МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР І КУЛЬТУРАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ
Мета заняття. Освоїти техніку посіву мікроорганізмів на щільні та рідкі живильні середовища та методи виділення чистих бактеріальних культур. Ознайомити студентів з основними культуральними характеристиками мікроорганізмів та методами визначення кількості бактерій.
Обладнання та матеріали. Бульйонні та агарові культуриВ. cereus, Е. coliтаS. aureusв пробірках і чашках Петрі, змішана бульйонна культураЕ. соliтаS. aureus, стерильні МПА та МПБ у пробірках, чашках Петрі, сольовий МПА (8 % хлориду натрію) у чашках Петрі, скляні шпателі, стерильні піпетки Пастера, бактеріологічні петлі.
Культура мікроорганізмів - це популяція (розплодка) клітин на живильному середовищі. Посів та пересівання культур мікроорганізмів на живильні середовища — найчастіший методичний прийом, який використовують для первинного виділення мікроорганізму з будь-якого об'єкта, а також для підтримки культур у життєздатному стані в лабораторних умовах.
Чиста культура - це популяція бактерій одного виду або біологічного варіанта (біовару), вирощена на живильному середовищі.
Штами - чисті культури мікроорганізмів одного виду, виділені з різних об'єктів або з одного й того самого об'єкта, але в різний час.
Колонія - макроскопічно видиме скупчення клітин мікроорганізму на поверхні або всередині щільного живильного середовища, що утворилися в результаті розмноження однієї життєздатної клітини. Тому колонію зазвичай розглядають як чисту культуру мікроорганізму.
Техніка посіву мікроорганізмів. Посіви з нативного матеріалу частіше проводять пастерівськоюпіпеткою, з культур мікроорганізмів-бактеріологічною петлею в зоні стерильного повітря над полум'ям пальника. На культуральних судинах (пробірки, чашки Петрі, колби тощо) пишуть номер експертизи, під яким зареєстрований матеріал, дату посіву.
Посів на рідке живильне середовище. Пробірку з досліджуваним матеріалом і пробірку з живильним середовищем тримають у лівій руці, в праву руку беруть бактеріологічну петлю або піпетку і пробки від пробірок (рис. 37). Над полум'ям пальника обпалюють краї пробірок, бактеріологічну петлю (піпетку) вводять у пробірку з матеріалом, переносять матеріал у пробірку зі стерильним живильним середовищем і струшують з петлі в середу, не змочуючи при цьому петлетримач. Краї пробірок знову проводять над полум'ям пальника, закривають пробірки пробками, стерилізують петлю та ставлять її в штатив. Використану піпетку опускають кінцем вниз у банку з розчином, що дезінфікує.
Посів на щільне живильне середовище. Виконують у різний спосіб.
При посіві в пробірку: 1) пробірки з мікробною культурою, що засівається, і живильним середовищем (МПА) беруть у ліву руку, пробірку з МПА тримають скошеною поверхнею середовища вгору. У відкриту у полум'я пробірку з мікробною культурою (або іншим матеріалом) вводять простерилізовану бактеріологічну петлю, злегка торкаючись петлею до поверхні середовища (матеріалу), беруть матеріал, переносять його в пробірку зі живильним стерильним середовищем. Петлю опускають до дна пробірки, занурюють у конденсаційну рідину і звивистим рухом проводять знизу вгору по поверхні середовища (посів «штрихом») (рис. 38). Пробірки закривають пробками, петлю пропалюють. Пробірки із посівами ставлять у термостат; 2) при посіві уколом у стовпчик середовища пробірку із щільним (нескошеним) середовищем берутьу ліву руку, над полум'ям пальника витягають із пробірки пробку, петлею з матеріалом проколюють вертикально по центру пробірки живильне середовище, петлю виймають, пропалюють, пробірку із засіяним середовищем закривають пробкою (рис. 39).
При посіві на чашку Петрі: чашку беруть у ліву руку, великим пальцем лівої руки злегка піднімають кришку, обпалюють на полум'ї пальника краю чашки в зоні щілини, вносять посівний матеріал на поверхню живильного середовища, потім розтирають його за допомогою скляного шпателя або бактерій 40).
Посів на напіврідке живильне середовище. Виконують методом уколу в стовпчик живильного середовища.
Виділення чистих культур мікроорганізмів. При бактеріологічному дослідженні шуканий мікроорганізм виявляють у матеріалі, як правило, у суміші з бактеріями інших видів. Класичними методами бактеріології можна ідентифікувати мікроорганізм лише за умови, що він знаходиться у вигляді чистої культури.
Методи, засновані на механічному роз'єднанні клітин. Ці методи найчастіше застосовують при виділенні чистих культур мікроорганізмів.
Метод Пастера (метод розведень): з досліджуваного матеріалу готують ряд послідовних, частіше десятикратних розведень на рідкому стерильному живильному середовищі в пробірках або колбах (10 -1 …10 -10 ). Припускають, що кількість мікробних клітин у кожному наступному розведенні буде меншою, ніж у попередньому, і в якійсь із пробірок залишиться тільки одна мікробна клітина, яка і дасть/початок чистій культурі мікроорганізму. Однак для успішного застосування цього методу необхідно, щоб мікроорганізм в матеріалі кількісно переважав над супутніми видами.
Метод Коха (метод заливок): досліджуваний матеріалневеликій кількості вносять у пробірку з розплавленим і охолодженим до 45. 50 "З МПА, перемішують, потім краплю живильного середовища переносять у другу пробірку з розплавленим МПА і т. д. Кількість розведень залежить від передбачуваної чисельності мікроорганізмів в досліджуваному матеріалі. виливають у стерильні чашки Петрі, після затвердіння середовища посіви поміщають у термостат.Фіксовані в щільному середовищі мікробні клітини при розмноженні формують колонії, з яких можна відщепити чисту культуру мікроорганізму.
Метод Дрігальського: беруть три-п'ять чашок Петрі з щільним живильним середовищем. В одну чашку вносять посівний матеріал і розподіляють його шпателем по поверхні живильного середовища. Не обпалюючи шпатель, матеріал, що залишився на ньому, послідовно розтирають на поверхні середовища в другій, третій та інших чашках. В останніх чашках Петрі після інкубування у термостаті зазвичай спостерігають формування ізольованих бактерій колоній.
Більше економічний наступний спосіб отримання ізольованих колоній. Бактеріологічною петлею з посівним матеріалом кілька разів роблять паралельні штрихи в одному секторі чашки Петрі з живильним агаром (рис. 41). Пет-олю пропалюють у полум'ї пальника, дають охолонути і частину матеріалу з першого сектора
Методи, засновані на біологічних особливостях мікроорганізмів. Спрямовані на пригнічення зростання супутньої мікрофлори.
Прогрівання: при виділенні чистої культури спороутворюючого виду бактерій досліджуваний матеріал прогрівають при 80 °С 20 хв або коротко кип'ятять. Вегетативні клітини супутньої мікрофлори в цих умовах гинуть, а суперечки шуканого мікроорганізму зберігають життєздатність і проростають після посіву наживильні середовища.
Використання селективних поживних середовищ, що містять речовини, що пригнічують зростання супутньої мікрофлори (антибіотики, барвники тощо), — найчастіший прийом для дослідження контамінованого матеріалу. Однак необхідно враховувати, що селективні фактори часто знаходяться не в бактерицидних, а в бактеріостатичних концентраціях, тому клітини супутніх мікроорганізмів не зростають, але залишаються життєздатними на поверхні живильного середовища і при відвиванні колоній досліджуваної культури на звичайні середовища можуть бути причиною отримання змішаної культури.
Біопроба – зараження чутливих лабораторних тварин – метод, за допомогою якого не лише виділяють збудник із патологічного матеріалу, але також вивчають вірулентність чистої культури. Організм тварини з її захисними факторами служить біологічним «фільтром», який знищує супутню непатогенну мікрофлору, але не здатний придушити розмноження вірулентних бактерій, що дозволяє досить легко виділити збудник у чистій культурі з тканин загиблої або вбитої з діагностичною метою тварини.
При виділенні чистих культур деяких видів бактерій використовують інші біологічні особливості. Наприклад, здатність мікроорганізму зростати при низьких (лістерії) або високих (термофільних бактеріях) температурах, що лежать за межами температурних діапазонів супутніх видів бактерій. Для виділення культури P. vulgaris використовують здатність даного виду давати повзуче зростання (роїння) на поверхні щільного живильного середовища. З цією метою матеріал, що містить P. vulgaris, засівають у конденсаційну воду на дні пробірки зі скошеним МПА, не торкаючись поверхні середовища. Супутня мікрофлора зростає в нижній частині живильного середовища, апротей у вигляді прозорої плівки поширюється вгору.
Для виділення С. tetani матеріал засівають точково на щільне живильне середовище у чашках Петрі та після вирощування відвивають культуру з периферії повзучого росту.
Культурні властивості мікроорганізмів. У процесі ідентифікації поряд з іншими властивостями у мікроорганізмів вивчають культуральні ознаки - особливості зростання на щільних, рідких та напіврідких живильних середовищах за певних умов.
На щільних середовищах вивчають колонії мікроорганізмів. Бактерії кожного виду формують колонії з певними ознаками, які зазвичай враховуються під час ідентифікації. Розмір колоній: великі – діаметром 4. 6 мм і більше, середні-2. 4 мм, дрібні - 1. 2мм та точкові колонії діаметром менше 1 мм. Форма колоній може бути правильною круглою, неправильною (амебоподібною, розеткоподібною), коренеподібною (рис. 42). Колір залежить від здатності мікроорганізму утворювати пігмент: білий, жовтий, червоний, синьо-зелений і т. д. Бактерії, що не синтезують пігмент, утворюють безбарвні колонії. Враховують характер поверхні, яка може бути шорсткою, блискучою, матовою, сухою, вологою, гладкою, радіально або концентрично смугастою. Краї колонії можуть бути рівними, хвилястими, зазубреними, бахромчастими, їх досліджують неозброєним оком та під малим збільшенням мікроскопа (рис. 43). Рельєф (профіль) визначають, розглядаючи колонію збоку; розрізняють плоскі, конусоподібні, куполоподібні, плоскі з конусоподібним центром або заглибленням у центрі колонії, з потовщеними (валикоподібними) краями (рис. 44). Враховують прозорість колонії: непрозора, напівпрозора, прозора. Структура може бути однорідною, зернистою, волокнистою тощо. (Рис. 45). Її виявляють при слабкому збільшеннімікроскоп. Консистенція може бути пастоподібною, слизовою, щільною (сухою) тощо; її визначають, торкаючись колонії бактеріологічної петлею. Колонії деяких видів вростають у товщу живильного середовища, що також визначають за допомогою бактеріологічної петлі. Запах: багато видів бактерій у процесі зростання на живильних середовищах виділяють специфічні ароматичні речовини.
Цінну додаткову інформацію про особливості будови колоній дає їх вивчення в косопадаючому пучку світла (рис. 46). Культури на прозорому агаровому середовищі у чашках Петрі поміщають на предметний столик бінокулярної лупи. Між бінокулярною лупою і джерелом світла поміщають дзеркало від мікроскопа увігнутою стороною вгору таким чином, щоб промені, відбиті від нього, потрапляли в площину об'єкта, що вивчається під кутом 40. 45°. Дзеркало встановлюють на рівному уда